УДК: 616.8-091.934:612.398.145.3
Год издания: 2013

Конструирование, экспрессия и получение рекомбинантного МОГ1-125 человека для количественного определения МОГ-специфичных аутоантител

Кожух Г.В.Власов А.П.Марцев С.П.Зафранская М.М.Борисов А.В.Рудаковская Е.Б.
Рубрики: 34.15.2776.03.3176.03.55
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий
Тема НИР: «Получение препаративных количеств апирогенных терапевтических препаратов рекомбинантного N-МОГ и разработка иммуноферментного метода оценки уровня МОГ-специфических аутоантител».
Сроки выполнения НИР: январь 2011 г. – декабрь 2013 г.
Научный руководитель: канд. биол. наук А.П. Власов.
Соисполнители: ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования».
Источник финансирования: госбюджет.

Цель - разработка метода получения препаратив­ных количеств апирогенного рекомбинантного вне­клеточного фрагмента миелин-олигодендроцитарного гликопротеина человека, служащего в качестве миели­нового антигена для целей иммуноферментного метода детекции МОГ-специфичных аутоантител в сыворотках крови пациентов с рассеянным склерозом (РС), а также в качестве супрессора иммунного ответа при трансплан­тации мезенхимальных стволовых клеток (МСК).

Миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ) - специфический антиген миелина централь­ной нервной системы, принадлежащий к суперсемей­ству иммуноглобулинов. Высокая энцефалитогенная активность МОГ указывает на его ведущую роль в ка­честве аутоантигена при демиелинизирующих заболе­ваниях, например, рассеянном склерозе. Точная пато­логическая роль аутоантител к МОГ при развитии РС, а также корреляция между их экспрессией и тяжестью развития РС до сих пор не установлена.

В качестве одного из современных подходов в пато­генетической терапии РС и других аутоиммунных заболеваний рассматривается клеточно-индуцированная толерантность, опосредуемая мезенхимальными ство­ловыми клетками, которые обладают способностью су­прессировать иммунный ответ и участвовать в репара­ции поврежденных тканей. В этой связи показаны до­стоверные различия в способности МСК супрессиро­вать миелин-индуцированную пролиферацию патоге­нетически значимых CD3CD45R0+ Т-клеток памяти у пациентов с РС.

Одним из эффективных путей получения МОГ, его внеклеточного N-концевого домена (1-125 а.к.) является создание бактериальной системы экспрессии методами мо­лекулярной биологии. Данный подход позволяет получить значимые количества полипептида в целях изучения про­цессов, участвующих в патогенезе рассеянного склероза.

Основой для создания плазмиды, кодирующей ре­комбинантный МОГ1-125, послужил вектор pET-22b (Novagen, Германия). Ген, кодирующий МОГ1-1255 чело­века, амплифицировали, используя в качестве матри­цы кДНК полноразмерного МОГ человека, клониро­ванную в родительский вектор pCMV6-XL5 (OriGene Technologies, США). Амплификация проводилась по стандартному протоколу, включающему 30 циклов по­лимеразной цепной реакции. Амплифицированный участок ограничивался прямым праймером, содержа­щим сайт рестрикции NdeI, и обратным праймером с сайтом XhoI. По данным сайтам в дальнейшем осу­ществлялось встраивание фрагмента в экспрессион­ный вектор pET-22b.

Генно-инженерные операции по получению экс­прессирующей плазмиды включали амплифика­цию гена, его перенос в клонирующий вектор pJET1/blunt (Fermentas, Литва), клонирование в экспресси­рующий вектор pET-22b по сайтам рестрикции NdeI и XhoI. Верификацию клонированного фрагмента, кодирующего МОГ1-125, осуществляли рестрикцион­ным анализом и прямым секвенированием по Сэнге­ру. Полученная генная конструкция при трансляции дает согласно данным гель-проникающей хромато­графии и масс-спектрометрии MALDI-TOF полипеп­тид с молекулярной массой ~15,5 кДа, что соответству­ет МОГ1-125 человека с дополнительным метионином на N-терминальном конце и гексагистидиновым пептидом на С-терминальном конце.

Экспрессию рекомбинантного МОГ осущест­вляли в бактериальных клетках E. coli штамма BL-21 (DE 3), индуцированных 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Уровень экспрессии в типичном случае составлял более 70 мг белка на 1 л культуральной среды. Целевой белок локализован пре­имущественно в тельцах включения, где составляет 50-70% суммарного белка.

Разработан эффективный метод ренатурации (рефолдинга) и хроматографической очистки бел­ка на твердой фазе с использованием эффективной металл-хелатной аффинной хроматографии на Ni-NTA Sepharose (Qiagen, США) сорбенте, образующем коор­динационные комплексы Ni с гексагистидиновым «тэ­гом» рекомбинантного МОГ1-1255.

МОГ1-125 в процессе выделения солюбилизировали в 6М гуанидин гидрохлориде и наносили на металл-хелатную колонку. Целевой белок специфично связы­вался с матриксом Ni-NTA Sepharose. После промывки и смены денатуранта на 8 М мочевину белок непосред­ственно на колонке рефолдировался путем создания понижающего линейного градиента мочевины и далее элюировался в нативных условиях буфером, содержа­щим 0,2 М имидазол. В результате получен высокоочи­щенный препарат МОГ1-125 в компактной нативной кон­формации с чистотой не менее 95%.

В целях дальнейших исследований, направленных на изучение процессов, участвующих в патогенезе рас­сеянного склероза, а также использования мезенхи­мальных стволовых клеток костного мозга в качестве клеточного трансплантата для пациентов с РС после стимуляции трансплантата рекомбинантным миели­новым аутоантигеном МОГ1-125, препараты МОГ были очищены от бактериальных эндотоксинов посред­ством хроматографических методов - анионообмен­ной и обращенно-фазовой хроматографии. Для дискри­минации эндотоксинов и белка использовался сильный анионообменник Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences, США). Препарат МОГ1-125 наносился на ионообменную колонку в Na-ацетатном буфере рН 4,5, в котором белок (pI> 6) заряжен положительно, а ли­пополисахарид (pI < 3) - отрицательно. Отрицательно-заряженные липополисахариды адсорбировались на сорбенте, в то время как положительно-заряженный МОГ1-125 свободно проходил через колонку. При ис­пользовании обращенно-фазовой хроматографии пре­параты МОГ1-125 наносились на колонку типа С8-HPLC Octyl Si 100 Polyol (Serva, Швеция) в подвижной фазе, содержащей 20% ацетонитрила. При этих условиях на­несения МОГ1-125 был не способен удерживаться не­подвижной фазой колонки С8 и элюировался. Эндо­токсины, напротив, удерживались неподвижной фазой и элюировались лишь при повышении концентрации ацетонитрила до 70%. Последовательно используемые анионообменная и обращенно-фазовая хроматография позволили достичь уровня эндотоксинов в препаратах МОГ1-125 ниже 2 ЕU/мг, что позволяет применить данный препарат в терапевтических протоколах лечения РС, основанных на трансплантации активированных МСК.

Одним из возможных путей вовлечения МОГ в процессы демиелинизации при РС является прямая индукция данных патологических процессов МОГ-специфичными аутоантителами. Разработка иммуно­ферментного анализа МОГ-специфичных аутоантител в сыворотках крови и установление корреляции между их экспрессией и тяжестью развития РС позволит про­яснить роль МОГ в патологии РС.

Необходимым условием для количественной оцен­ки антител при иммуно-ферментном анализе являются стандарты-калибраторы, позволяющие откалибровать уровни измеряемых сигналов.

В качестве стандартов-калибраторов, необходимых для оценки уровня МОГ-специфичных аутоантител в сыворотках, предпочтительно использовать природсредственно из сывороток крови человека. Для создания МОГ-специфичных IgG использовалась аффинная хрома­тография на основе BrCN-активированной сефарозы, где в качестве лиганда выступал рекомбинантный МОГ1-125.

Для получения антител, специфичных к МОГ, на первом этапе при помощи сульфат-аммонийной пре­ципитации и гель-фильтрации была получена общая фракция IgG из сывороток крови от 10 пациентов, стра­дающих рассеянным склерозом. Данная пулированная фракция использовалась в дальнейшем для получения МОГ-специфичных IgG.

Для проведения аффинной хроматографии на ко­лонку, содержащую 2 мл МОГ-BrCN-сефарозы, нано­сили общую фракцию IgG, полученную из сыворотки пациентов, страдающих рассеянным склерозом, в PBS. Далее промывали колонку буфером PBS. Фракцию IgG, аффинносвязанную с МОГ-сефарозой, элюиро­вали 0,1 М глицин-HCl буфером, содержащим 150 мМ NaCl, рН 2,3. Полученный пул МОГ-специфичных IgG в дальнейшем использовали в качестве стандартов-калибраторов при разработке твердофазного ИФА.

Таким образом, в результате комбинации методов генетической и белковой инженерии получен апиро­генный рекомбинантный N-терминальный внеклеточ­ный фрагмент МОГ1-125 человек, как модулирующий агент для МСК при аутотрансплантации пациентоам с РС, а также как основной компонент иммунохими­ческой системы для количественного определения ау­тоантител к МОГ - возможных маркеров рассеянного склероза. Создается лабораторная иммуноферментная тест-система для определения аутоантител к МОГ.


Область применения: белковая инженерия, лабораторная диагностика, иммунология.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования и технологические разработки в области конструирования белков и иммунохимических систем анализа.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта