Разработка зондов ДНК-метилирования в качестве молекулярных маркеров для прогнозирования статуса лейкемического процесса в настоящее время являет­ся актуальной проблемой клинической гематологии. Alu-повторы - семейство высокоповторяющихся по­следовательностей ДНК длиной около 300 н.п. в гено­ме человека. Обладая собственной промоторной или энхансерной активностью, Alu-повторы могут усили­вать транскрипцию близлежащих локусов. Проведен биоинформационный анализ Alu-повторов в 5’-обла­сти гена множественной лекарственной устойчивости и сопоставлен характер Alu-элементов с «пейзажем» метилирования ДНК изучаемой области гена MDR1. В качестве исходного материала для выделения ДНК были использованы лейкоциты периферической крови и ядросодержащие клетки костного мозга пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ), острым миело­бластным лейкозом (ОМЛ), острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ).

Геномную ДНК выделяли методом фенол-хлороформенной экстракции, проводили амплифика­цию полимеразных цепей- с праймерами, фланкирую­щими сайты узнавания используемых ферментов. Ха­рактер метилирования остатков цитозина определялся по присутствию или отсутствию продуктов амплифи­кации. Кроме того, образцы ДНК подвергались иссле­дованию методом бисульфитного секвенирования.

Проведенный биоинформационный анализ на осно­ве данных бисульфитного секвенирования промотор­ной области 5’-области гена множественной лекар­ственной устойчивости выявил наличие Alu-повторов. Исследованный фрагмент содержал один из подтипов Alu-повторов, но в отличие от типичных, «канониче­ских» Alu-повторов, в нем присутствовало также мно­го CCWGG-сайтов потенциального метилирования. Изученный фрагмент был обеднен CCGG-сайтами. Ме­тодом бисульфитного сиквенса обнаружено несимме­тричное метилирование 5’-области гена множествен­ной лекарственной устойчивости. Сравнительный ана­лиз промоторной области с использованием метилчув­ствительной ПЦР также выявил существенное разли­чие между «пейзажем» метилирования при лимфо­идных и миелоидных опухолях. Эти различия носи­ли реципрокный характер: гиперметилирование по CCWGG-сайтам и деметилирование по CCGG-сайтам при миелоидных лейкозах (ОМЛ и ХМЛ) и деметили­рование по CCWGG-сайтам с гиперметилированием по CCGG-сайтам при ОЛЛ. Таким образом, «пейзаж» ме­тилирования промоторной 5’-области MDR-1 гена за­висит не только от воздействия цитостатической тера­пии, но и от природы опухолей.

В норме CCGG-сайты 5^,-области гена MDR1 не ме­тилированы, на это указывает отсутствие продуктов амплификации. При анализе CpG-метилирования ДНК пациентов с острым миелоидным лейкозом нами обна­ружено гиперметилирование всех исследуемых сайтов только в случае с одним образцом; об этом свидетель­ствует амплификация фрагментов с обеих пар прайме­ров. В то же время ПЦР-анализ других образцов ДНК пациентов с ОМЛ не выявил такого тотального мети­лирования этих сайтов. Продемонстрировано наличие CCWGG-метилирования в образцах ДНК, выделенной из ядросодержащих клеток периферической крови. Та­ким образом, получены новые приоритетные данные об особенностях метилирования промоторов генов каль­цитонина, р21 и MDR-1 со специфичностью CCGG и CCWGG. Сконструированы праймеры для геномного секвенирования фрагмента промотора гена MDR-1 и оптимизирован метод бисульфитного сиквенса. Прове­дено геномное секвенирование специфического фраг­мента промотора гена MDR-1. На исследованном фраг­менте промотора MDR-1, характеризующемся наличи­ем CNG- метилирования, впервые было показано не­симметричное CN-метилирование.

Впервые предлагается использовать деметилиро­вание специфических последовательностей в качестве молекулярного маркера. Предложен возможный моле­кулярный механизм, лежащий в основе функциональ­ных связей патологического изменения метилирования промотора гена MDR1 с развитием множественной ле­карственной устойчивости. Деметилирование 5’-про­моторной области гена MDR-1 часто коррелирует с экс­прессией самого гена, что, вероятно, связано с селекци­ей резистентного клона лейкозных клеток с фенотипом множественной лекарственной устойчивости в процес­се лечения лейкемии

Также обращает на себя внимание большее сниже­ние уровня метилирования 5’-области MDR1-гена (и соответственно повышение транскрипционной актив­ности MDR1 - мРНК) при лейкозах миелоидного ряда по сравнению с образцами ДНК/РНК пациентов с ОЛЛ. Особенно характерно деметилирование и нарастание экспрессии мРНК по мере прогрессии ХМЛ. Анало­гичная корреляция наблюдается и у пациентов с остры­ми лейкозами (особенно при ОМЛ). Она не столь выра­жена, хотя тенденция остается прежней. Полученные данные свидетельствуют, что приобретение фенотипа множественной лекарственной устойчивости харак­терно для пациентов с лейкемиями и более для ХМЛ и лейкозов миелоидного ряда, нежели для ОЛЛ. Этот процесс напрямую связан с эпигенетической модифи­кацией (метилированием) ДНК.

Установлено, что в промоторной зоне 5’-обла­сти гена множественной лекарственной устойчиво­сти имеется наличие Alu-повторов. «Пейзаж» мети­лирования промоторной 5’-области MDR-1 гена зави­сит не только от воздействия цитостатической тера­пии, но и от природы опухоли. «Пейзаж» метилиро­вания регуляторно-промоторной области гена множе­ственной лекарственной устойчивости, коррелирую­щий с экспрессией гена и может служить ранним мар­кером селекции опухолевого клона, резистентности к терапии и опухолевой прогрессии.

Патентная защита: подготовлена заявка на патент.