УДК: 616-007.43-089.844:576.524
Год издания: 2013

Адгезионный интерфейс для применения аутологичных клеток в герниопластике

Петренев Д.Р.Берещенко В.В.Воропаев Е.В.Лызиков А.Н.
Рубрики: 34.57.2176.09.3176.09.4176.29.46
Гомельский государственный медицинский университет
Тема НИР: «Разработать и внедрить клеточные технологии для оптимизации репаративных процессов поврежденного железистого эпителия и сосудистых компонентов органов».
Сроки выполнения НИР: январь 2011 г. — декабрь 2013 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. А.Н. Лызиков.
Источник финансирования: госбюджет.

Герниопластика - наиболее часто выполняемая операция в хирургических отделениях общего профи­ля. Многочисленными исследованиями убедительно доказаны преимущества операций с применением до­полнительных пластических материалов перед тради­ционными способами. В то же время использование имплантационных технологий вызывает ряд ослож­нений в месте протезирования. Основные причины осложнений - инфицирование протеза и нарушение процессов регенерации соединительной ткани. Первая проблема решается за счет использования сетчатых эндопротезов, изготовленных из монофиламентной полипропиленовой нити. Их структура и низкая ад­гезионность обеспечивает наименьшую вероятность инфицирования эндопротеза. Вторая проблема может быть преодолена путем введения аутологичных фибро­бластов или мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в область регенерации. Эти клетки продуцируют боль­шое количество ростовых факторов, что в свою оче­редь обеспечивает ускорение процессов ремоделинга тканей, сокращение сроков выздоровления и снижение риска развития осложнений.

Тем не менее, практическое использование клеточ­ных технологий в герниопластике ограничено низкими адгезивными свойствами полипропиленовых протезов. Фактически закрепление клеток на поверхности по­липропиленового эндопротеза наблюдается в области узлов и пересечения нитей. Таким образом, разработ­ка способов фиксации аутологичных клеток на его по­верхности является актуальной задачей.

Цель - изучить возможность фиксации живых ау­тологичных фибробластов на сетчатом полипропиле­новом эндопротезе посредством формирования адгези­онного интерфейса для клеток на его поверхности.

Для изучения процессов клеточной адгезии in vitro использовали хирургическую сетку (диаметр нити 0,12 мм, толщина сетки 0,5 мм, поверхностная плотность 62 г/м2, объемная пористость 85%). Диски из сетки o 55 мм стерилизовали в плазме H2O2. Адгезионный интер­фейс из поликапролактона формировали на поверхно­сти сетки методом испарения растворителя на стеклян­ной подложке в ламинарном потоке воздуха.

Динамику роста клеток in vitro на поверхности сет­чатого протеза изучали с применением первичных фи­бробластов. Для этого в чашки Петри (ЧП) o 60 мм по­мещали образцы сетки, вносили 5 мл суспензии кле­ток (2х106кл) в полной среде (DMEM, 41966 GIBCO; L-глютамин 4 мМ; 10 мМHEPES; 1% антибиотик/ан­тимикотик; 10% ЭТС) и инкубировали при 37°C и 5% CO2. Замену среды проводили 2-3 раза в неделю. При­жизненное микроскопирование образцов в проходя­щем свете производили на инвертированном микроско­пе типа XDS-3FL4. На 14 сут сетки отмывали, фикси­ровали 2% параформальдегидом и выполняли флуорес­центные исследования.

Культуру первичных фибробластов кожи крысы (Вистар) получали стандартным методом изоляции фи­бробластов, мигрирующих из эксплантатов. Рутинное культивирование проводили в полной среде при 37°C и 5% CO2 в 60 мм ЧП для культивирования адгезионных культур (83.1801 SARSTEDT). В эксперимент брали клетки пятого пассажа.

На ранних этапах культивирования наблюдали практически полное отсутствие адгезии фибробластов к полипропиленовой хирургической сетке, что соответ­ствует ранее полученным результатам для МСК. Через 24 ч после внесения клеток в ЧП в области узлов сетки и на пересечении нитей выявляли единичные клеточ­ные элементы. Остальные клетки формировали моно­слой на дне ЧП. В ЧП с сеткой с покрытием клетки были сосредоточены на полимерном покрытии в виде кластеров. На 3 сут культивирования при увеличении количества клеток вышеописанный характер их рас­пределения между поверхностью ЧП и эндопротезом сохранялся (рис. 1).

На 7 сут в ЧП с контрольными образцами наблю­дали формирование 100% монослоя с характерными признаками старения клеточной популяции. Также от­мечали начало восходящего прорастания монослоя че­рез узлы сетки. Ранее сообщалось о похожем феномене в культуре МСК. В ЧП с сетками с покрытием клетки на поверхности чашек имели распластанную морфоло­гию с большим количеством отростков при плотности монослоя от 20 до 70%. Клетки на поверхности поли­мерного покрытия замедлили рост и приобрели более компактную форму.

На 7 сут в ЧП с контрольными образцами наблюда­ли формирование 100% монослоя с характерными при­знаками старения клеточной популяции. Также отмечали начало восходящего прорастания монослоя через узлы сетки. Ранее сообщалось о похожем феномене в культуре МСК. В ЧП с сетками с покрытием клетки на поверхности чашек имели распластанную морфологию с большим количеством отростков при плотности мо­нослоя от 20 до 70%. Клетки на поверхности полимер­ного покрытия замедлили рост и приобрели более ком­пактную форму.


Рис. 1. Вид поверхности ЧП (a, c) и полипропиленового сетчатого протеза без покрытия (b) и покрытого поликапролактоном (d) на 3 сут культивирования с первичными фибробластами крысы (2х106кл). ЧП с сеткой с покрытием (с, d) и без (a, b)

На 14 сут культивирования in vitro, на нитях необ­работанной сетки наблюдали формирование монослоя фибробластов, прорастающих из узловых регионов и распространяющихся вдоль волокон (рис. 2). Ранее в аналогичной экспериментальной модели с МСК подоб­ного эффекта не наблюдали. В эти же сроки на поверх­ности полимерного покрытия наблюдали формирова­ние относительно равномерного клеточного монослоя (рис. 2) без заметной деструкции полимера.


Рис. 2. Вид поверхности полипропиленового сетчатого протеза покрытого поликапролактоном (a) и без покрытия (b) на 14 сут культивирования с первичными фибробластами крысы (2x106кл). Слева красная аутофлуоресценция элементов сетки и цитоплазмы метаболически активных клеток (резофурин) и справа синее свечение ядер клеток (DAPI)

Сформированное на поверхности сетчатого полипропиленового протеза покрытие из поликапролактона увеличивает адгезионные свойства эндопротеза и обе­спечивает формирование на его поверхности моносло­яметаболически активных фибробластов при культиви­ровании in vitro. Данное свойство может быть исполь­зовано для закрепления аутологичных клеток на по­верхности эндопротеза.


Область применения: модификация поверхности эндопротеза для герниопластики, клеточная трансплантология, регенеративная медицина.
Рекомендации по использованию: предложенный метод формирования адгезионного интерфейса на поверхности эндопротеза может быть использован для создания биосовместимого покрытия, которое улучшает показатели адгезии клеточных элементов соединительной ткани в месте имплантации, а также для предимплантационного закрепления на его поверхности аутологичных клеток in vitro. Кроме того, покрытие может быть использовано в качестве депо биологически активных соединений (антибиотики, инсулин, ростовые факторы), что обеспечит адресную доставку этих соединений и стимуляцию репарационных процессов в области оперативного вмешательства.
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь при внедрении, изготовление по заказам единичных изделий и малых партий продукции, совместное доведение технологии до промышленного уровня, совместные исследования в области разработки и применения клеточных технологий в трансплантологии.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2022 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта