УДК: 616.832-018:577.21]:616-089.843
Год издания: 2013

Молекулярно-генетическая характеристика и поверхностный фенотип культур мезенхимальных стволовых клеток, пригодных для трансплантации

Кондрачук А.Н.Петренев Д.Р.Рубаник Н.Н.Воропаев Е.В.
Рубрики: 34.15.2376.35.33
Гомельский государственный медицинский университет
Тема НИР: «Разработать и внедрить клеточные технологии для оптимизации репаративных процессов поврежденного железистого эпителия и сосудистых компонентов органов».
Сроки выполнения НИР: январь 2011 г. — декабрь 2013 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. А.Н. Лызиков.
Источник финансирования: госбюджет.

Цель - изучение динамики экспрессии поверх­ностных антигенов и экспрессии генов, маркерных для культуры мезенхимальных стволовых клеток. Охарак­теризовать морфофункциональные свойства мезенхи­мальных стволовых клеток выделенных из жировой ткани и костного мозга лабораторных животных.

С развитием клеточных технологий все большее число исследователей занимается вопросами биоло­гии, культивирования, экспериментального и клини­ческого применения постнатальных стволовых клеток. При этом ключевую позицию занимают исследования мезенхимальных стволовых клеток (МСК), что обу­словлено доступностью методик их получения, экспан­сии in vitro и наличием ряда специфических полезных свойств. Анализ МСК различного тканевого происхо­ждения имеет немаловажное теоретическое и прак­тическое значение. С фундаментальной точки зрения важно понимать, имеются ли какие-либо специфиче­ские отличия МСК в зависимости от их локализации в тех или иных тканевых нишах и их принадлежно­сти к развивающимся или зрелым, дефинитивным тка­ням (плацента, костный мозг и жировая ткань взрос­лого организма). Результаты сравнительных исследо­ваний различных типов МСК могут иметь и практиче­скую ценность, например, для оптимизации техноло­гий трансплантации МСК. Очевидно, что эффектив­ность лечения с использованием МСК во многом бу­дет определяться их биологической активностью, ко­торая, в свою очередь, может непосредственно зави­сеть от таких факторов, как источник их получения и особенности экспансии in vitro. В клинической практи­ке наиболее безопасным считается использование ау­тологичного клеточного материала. Однако использование МСК в целях аутотрансплантации диктует необ­ходимость предварительной оценки их морфофункци­онального состояния и фенотипических характеристик для подтверждения адекватности трансплантируемого материала.

Для получения культуры МСК использовались ла­бораторные мыши линии С57Bl/6, 6-8-недельного воз­раста, массой 20±5 г. Для фенотипической характери­стики полученных культур МСК использовали следу­ющую панель моноклональных антител: CD11b FITC (маркер моноцитов/макрофагов), CD44 PE (рецеп­тор гиалуроната и остеопонтина), CD45 FITC (пан-лейкоцитарный маркер), CD90.2 FITC (Thy1, маркер дифференцировки тимоцитов, пан-T-клеточный мар­кер), CD105 PE (эндоглин), CD117(c-kit) PE, Anti-Sca-1 FITC. В анализ брали прилипающую фракцию кле­ток красного костного мозга после 1, 10 и 21 дней суб­культивирования. На начальных этапах субкультиви­рования преобладали гемопоэтические клетки, неэк­спрессирующие маркер Sca-1. К 10 сут культивирова­ния доля Sca-1 позитивных клеток возрастала до 15%, а на 21 сут до 52%. Таким образом, в культуре наблю­далась смена субпопуляционного состава за счет преи­мущественного деления МСК и элиминации гемопоэ­тических клеток. Отдельно следует отметить тот факт, что интенсивность свечения Sca-1 позитивных клеток значительно снижалась в 10 и 21-суточных культурах, что может свидетельствовать об уменьшении плотно­сти рецепторов Sca-1 на поверхности клеток в эти сро­ки. Одной из проблем при анализе данных методом проточной цитометрии было наличие в клеточной по­пуляции элементов с высокой аутофлуоресценцией, что затрудняло выявление специфического сигнала по ка­налам FL1 (Sca-1) и FL2 (CD44). Эти клетки были ис­ключены из анализа по показателю бокового светорас­сеивания, что позволило произвести анализ уровня экс­прессии рецептора CD44. В дальнейшем была произве­дена оптимизация протокола проточного флуоресцент­ного анализа для снижения уровня аутофлуоресценции элементов клеточных суспензий.

Методом ПЦР в реальном времени с применением интеркалирующего красителя Sybr Green, по соответ­ствующему протоколу был проведен анализ уровней экспрессии генов, которые являются важными для по­пуляционной идентификации МСК и направления их дифференцировки. Были определены уровни экспрес­сии следующих генов, необходимых для характеристи­ки культуры МСК: Ly6a (Sca-1), Pecam (CD31), Ptprc (CD45), Cd34, Prominin (CD133), Cd44, Acan (aggrecan). Результаты были нормализованные по β-actin, GADPH и уровню экспрессии (ΔCt). Полученные результаты подтверждают выявленные ранее методом проточной цитометрии данные о снижении уровня экспрессии гена Sca-1 в общей популяции культивируемых клеток на 10 и 21 сут. Также отмечено увеличение уровня экс­прессии CD44 в общей популяции клеток. Этот эффект, очевидно, связан с увеличением доли CD44+ клеток с 6% на 1 сут до 16 и 52% на 10 и 21 сут культивирова­ния соответственно. При этом плотность поверхност­ного антигена CD44 на клетках была снижена в этот период по сравнению с клетками после 1 сут инкуби­рования. Увеличение экспрессии генов CD133 и CD45 в общей популяции клеток свидетельствует о том, что на протяжении всего срока культивирования в культу­ре присутствуют гемопоэтические клетки. Нараста­ющая динамика экспрессии этих генов может свиде­тельствовать о формировании очагов кроветворения in vitro. Это предположение подтверждается тем фактом, что снижение экспрессии генов, кодирующих рецепто­ры CD34, наблюдавшееся на 10 сут, постепенно возвра­щается к норме (1 сут) к 21 сут. Динамика уровня экс­прессии гена Pecam свидетельствует о снижении при­меси эндотелиальных клеток и зрелых клеток гемопоэ­тического ростка. В то же время появление экспрессии гена Acan на 10 сут культивирования может свидетель­ствовать о начальной стадии хондрогенной дифферен­цировки отдельных клеток. Таким образом, при отсут­ствии факторов среды, влияющих на путь дифференци­ровки МСК, может происходить спонтанный выбор фе­нотипа, по крайней мере, частью клеток.

Методом проточной цитометрии установлено, что количество клеток Sca-1+, CD44+ возрастает с 6 до 52% в течение срока культивирования (21 сут), при этом ин­тенсивность флуоресцентного свечения указанных по­верхностных антигенов снижается, что согласуется с данными экспрессии аналогичных генов, полученны­ми с помощью ПЦР в реальном времени. На протяже­нии всего срока культивирования присутствует значи­тельное количество гемопоэтических клеток различ­ных субпопуляций (CD133 и CD45), что подтвержда­ется результатами иммунофенотипирования и опреде­ления экспрессии генов методом ПЦР в реальном вре­мени. Показана значительная гетерогенность и направ­ленность к дифференцировке клеточного состава полу­ченных культур.


Область применения: молекулярная и клеточная биология, трансплантология, регенеративная медицина.
Рекомендации по использованию: полученные результаты могут применяться в практике научных исследований в лабораториях, занимающихся культуральными клеточными технологиями.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования в области разработки и применения клеточных технологий в трансплантологии.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2022 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта