Клеточная иммунотерапия с использованием есте­ственных киллерных (ЕК) клеток является перспектив­ной терапевтической стратегией для лечения пациентов с различными типами новообразований. В связи с тем, что по количеству ЕК клетки составляют небольшую фракцию лимфоцитов периферической крови, акту­альным является разработка оптимальных протоколов получения максимального количества эффективных цитотоксических клеток. В настоящее время исполь­зуются различные методы экспансии и активации ЕК: от краткосрочной активации до долгосрочного куль­тивирования в присутствии цитокинов, мононуклеар­ных клеток, различных клеточных линий, в т.ч. EBV-трансформированных и др.

Цель - оценка эффективности экспансии, активации и противоопухолевого потенциала ЕК клеток в присут­ствии интерлейкина (ИЛ)-2, ИЛ-15 и их комбинации с ИЛ-21; анализ влияния криоконсервирования на экспан­сию, фенотип и цитотоксическую активность ЕК клеток.

Объектом исследования являлись ЕК клетки, по­лученные из мононуклеарных клеток периферической крови 21 здорового донора. МНК выделяли из перифе­рической крови на градиенте плотности при 400g 30 мин, дважды отмывали в культуральной среде.

Использованы культуральные методы, метод про­точной цитофлуориметрии.

Для исследования экспансии ЕК клеток предвари­тельно проводили их селекцию иммуномагнитным способом из МНК. Чистота выделения достигала 91,6±1,2%. До селекции количество ЕК клеток соста­вило 18,9% от лимфоцитов и 13,7% от всех клеток, тог­да как после селекции - 96,8% от лимфоцитов, 77% от всех клеток. После выделения ЕК клетки культиви­ровали в присутствии цитокинов - ИЛ-2, ИЛ-15 и их комбинации с ИЛ-21. Исследуемые цитокины индуци­руют пролиферацию ЕК клеток. Так, на 21 сут инкуба­ции прирост ЕК клеток в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-15 составил 13,6±3,3 и 12,5±3,0 соответственно, при до­бавлении ИЛ-21 к ИЛ-2 и ИЛ-15 - 18,0±5,2 и 17,1±4,9 раз соответственно. В контрольных образцах без до­бавления цитокинов роста ЕК не наблюдалось. На 21 день среди экспансированных наибольшее количество составляли ЕК клетки - более 80%.

Далее был проанализирован уровень активации ЕК клеток, определенный по экспрессии поверхностно­го маркера CD69, в присутствии используемых цито­кинов. В наших исследованиях показано достоверное (р<0,05) увеличение процента активированных ЕК кле­ток при их культивировании с ИЛ-2 и ИЛ-15 по срав­нению с контрольными образцами на 0 день. На 21 сут более 90% ЕК клеток экспрессировали маркер CD69. При этом добавление ИЛ-21 не способствовало допол­нительному усилению активации.

Также оценивали функциональную активность экс­пансированных ЕК клеток. В ходе данных эксперимен­тов было показано, что каждый из изучаемых цито­кинов - ИЛ-2 и ИЛ-15 достоверно (р<0,05) повышал прямую цитотоксическую активность ЕК клеток в отно­шении опухолевой линии К-562 на 7, 14 и 21 сут наблю­дения по сравнению с лизисом К-562, определенным на 0 день. При соотношении эффектор:мишень 5:1 наблю­дали гибель 60% клеток-мишеней на 21 день культиви­рования. Сочетание ИЛ-2 и ИЛ-15 с ИЛ-21 не способ­ствовало усилению противоопухолевой активности ЕК.

Цитотоксическую активность ЕК клеток также определяли по экспрессии маркера CD107a. CD107a (LAMP-1 - lysosomal associated membrane glycoprotein) является белком мембраны литических гранул, со­держащих гранзим и перфорин. Проведенные нами исследования показали, что инкубация ЕК клеток в присутствии опухолевой линии К-562 способствовала достоверному повышению доли ЕК, экспрессирую­щих CD107a. Дополнительная стимуляция эффекторов в присутствии ИЛ-2, ИЛ-15 и их комбинации с ИЛ-21 приводила к увеличению экспрессии CD107a на иссле­дуемой популяции лимфоцитов.

Также выявлено, что селектированные интактные (неактивированные) ЕК клетки могут быть подверже­ны процедуре заморозки и криохранению без значи­тельного изменения их функциональной активности. После разморозки такие ЕК клетки сохраняли способ­ность к экспансии, активации и цитотоксической ак­тивности в присутствии ИЛ-2 на уровне, сопоставимом с ЕК клетками, не подвергавшимися заморозке.