Цель - определение количественного уровня экс­прессии разных РНК-транскриптов гена Ikaros при ОЛЛ по сравнению со здоровым костным мозгом, а также со­поставить профиль экспрессии этого гена с наличием делеций в локусе IKZF1 при ОЛЛ.

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) относят к наиболее распространенным онкологическим заболева­ниям у детей; включает более 80% всех лимфопроли­феративных заболеваний детского возраста. Хотя общая выживаемость достигает 70-75%, рецидивы заболева­ния остаются существенной проблемой. Классическая диагностика лейкозов как в Республике Беларусь, так и в мировой практике опирается на традиционные ме­тоды: цитоморфологическое исследование, иммуно­фенотипирование с помощью проточной цитометрии, цитогенетический анализ (G-banding) и ПЦР-анализ экспрессии основных химерных онкогенов. В послед­ние годы в крупных мировых онкологических центрах наблюдается все более возрастающая ориентация на более глубокий уровень диагностических и прогно­стических исследований, в первую очередь выявление молекулярно-генетических изменений (мутаций) с от­слеживанием минимальной остаточной болезни. Имен­но эти анализы позволяют наиболее приблизиться к пониманию этиологии и патогенеза заболевания, стра­тификации по группам риска, поиска новых мишеней для терапии и адекватной оценки эффективности те­рапии. Массивный прорыв исследований в этой сфере происходит в последнее десятилетие в связи с появле­нием технологии DNA-arrays, в первую очередь EST-array (expressed sequence tags) для анализа экспрессии, CGH- (comparative genomic hybridization) и SNP- (single nucleotide polymorphism) arrays для выявления делеций/вставок и однонуклеотидных замен, соответственно, тысяч генов одновременно. Помимо давно известных перестроек при ОЛЛ, таких как BCR/ABL, E2A/PBX, TEL/AML1 и MLL, обнаружено огромное количество несбалансированных криптических транслокаций, микроскопических делеций и точечных мутаций дру­гих генов. Однако значительный интерес представляют гены транскрипционных факторов (ТФ), специфиче­ски контролирующие лимфоидную дифференцировку, такие как pax5, EBF-1, IKZF1 (Ikaros), IKZF2 (Helios), IKZF3 (Aiolos). Структурные изменения в этих генах обнаружены у 40% пациентов с В-линейным ОЛЛ, осо­бенно для pax5 гена (31,7%) и Ikaros (28,6%).

Ikaros, кодируемый геном IKZF1, наряду с другими генами IKZF2 (Helios), IKZF3 (Aiolos), Eos и Pegasus от­носятся к ДНК-связывающим белкам семейства Круп­пела с цинковыми пальцами. Ikaros является ключе­вым транскрипционным фактором, регулирующим ранние этапы дифференцировки Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток и дендритных клеток. Гомозиготный knock-out гена IKZF1 у мышей ведет к тяжелому комбиниро­ванному иммунодефициту, тогда как гетерозиготный knock-out этого гена приводит к усиленной лимфопро­лиферации, высокой частоте спонтанных Т-клеточных лейкозов и лимфом, а также аутоиммунным заболева­ниям. Это послужило поводом для доказанного позже предположения о роли этого гена в качестве опухолево­го супрессора: нарушение его функции у человека ха­рактерно для В-лимфоидных лейкозов.

Регуляция функции гена IKZF1 (Ikaros) в норме осуществляется при участии механизма альтерна­тивного сплайсинга. Белок Ikaros, как и другие чле­ны семейства Ikaros, включают два отдельных до­мена с цинковыми пальцами: 4 ДНК-связывающих цинковых пальца N-конца и 2 цинковых пальца для белок-белковых взаимодействий около С-конца. Ген Ikaros включает семь экзонов и транскрибируется по меньшей мере в 14 различных изоформ по средствам альтернативного сплайсинга с использованием аль­тернативных экзонов (рис. 1). Так, Ik-1, Ikx, Ik-2, и Ik-3, которые содержат, по меньшей мере, три цин­ковых пальца на N-части, сохраняют высокоаффин­ное ДНК-связывание и локализуются в ядре. Изо­формы Ik-4-Ik-10, которые имеют менее трех цинко­вых пальцев, теряют свою ДНК-связывающую актив­ность и локализуются в цитоплазме. Сверхэкспрес­сия коротких изоформ Ikaros, в первую очередь Ik6, была описана при ОЛЛ.

Применение метода сравнительной геномной гибри­дизации (CGH-arrays) в последнее десятилетие показа­ло, что соматические внутригенные делеции в локусе IKZF1 являются очень распространенными при ОЛЛ и составляют 15-20% детских ОЛЛ, 30-50% взрослых ОЛЛ и до 75% BCR-ABL1 позитивных лейкозов. Наи­более частой является делеция кодирующих экзонов 3-6 - одна из причин сверхэкспрессии короткой изо­формы Ik6. Ряд исследований доказал, что делеции в гене IKZF1 являются независимым неблагоприятным прогностическим маркером. Связь между делециями в локусе IKZF1 и изменениями в сплайсинге гена, а также прогностическое значение экспрессии разных изоформ этого гена так и остались не до конца изученными.

1. Пациенты и образцы клеток

Материалом исследования были образцы клеток костного мозга детей, больных острым лейкозом. На данном этапе размер выборки составляет 172 отдель­ных анализируемых образца от 130 пациентов с ОЛЛ. Среди них 116 образцов первичного ОЛЛ и 56 рециди­вов. Поскольку одна из задач всего проекта - изучение участия генов ТФ в рецидивировании ОЛЛ, мы стара­лись включить в исследование максимально возможное количество парных случаев: первичный - рецидив. В анализируемой выборке 38 парных случаев, в т. ч. 32 пары первичный ОЛЛ - рецидив и 5 пар рецидив пер­вый - рецидив второй, 1 пара из двух рецидивов. Из 172 образцов ОЛЛ 147 имеют В-клеточный иммунофе­нотип, 25 - Т-клеточный.

Еще 36 образцов составляли контрольную или модель­ную группу. Основным адекватным контролем является костный мозг здоровых доноров. Восемнадцать образцов здорового КМ и 4 образца здоровых доноров перифериче­ской крови (ПК) составляли контрольную группу.

2. Выделение мононуклеарных клеток (МНК), выделение РНК и синтез кДНК

Образец КМ (ПК) наслаивали на 0,5 объема Histopaque 1077 (Sigma, США) и центрифугировали при комнатной температуре в течение 25 мин при 1000 g. Интерфазный слой, содержащий МНК, переносили в чистую пробирку и дважды отмывали в ФСБ (400 g, 10 мин, при +40°С) и подсчитывали микроскопически в камере Горяева. Выделение суммарной РНК проводили с использованием набора Tri-Reagent в соответствии с инструкциями производителя. Обратной транскрип­цией кДНК было получено из РНК с использовани­ем Oligo-dT18 (Праймтех, РБ) MMLV транскриптазы (Promega, США) либо Superscript® IIIRT (Invitrogen, США).

3. Количественный анализ экспрессии методом ПЦР «в реальном времени» и ПЦР-анализ делеций в гене IKZF1

Мы использовали вариант RQ-PCR с парой прай­меров и TaqMan-зондом, меченным флуоресцентной меткой FAM, JOE, или ROX на 3’-конце и гасителем 5’BHQ. Последовательность праймеров и зондов были подобраны нами для изолированного измерения каж­дой изоформы. Реакция проводилась в 20 мкл с 50% 2х TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems, USA), 500 нг ДНК, 500 нг каждого праймера и 150 нг ТМ-зонда. Анализ проводился на приборе Rotor-Gene 6000 (CorbettResearch, Австралия). Делеции ΔEx3-6 и ΔEx1-6 определялись с помощью традиционной ПЦР с праймерами, подобранными к соответствующим ин­тронам на удалении в 300-400 нуклеотидов от предпо­лагаемой точки разрыва.

Профиль экспрессии транскриптов гена Ikaros в нормальном костном мозге и при ОЛЛ

Прежде всего, мы оценили уровень экспрессии изо­форм гена Ikaros в образцах нормального костного моз­га здоровых доноров. Следует отметить, что транскрип­ты Ikaros сами по себе не являются патогенетически­ми и встречаются в нормальных гемопоэтических клет­ках. Патогенетическое значение сверхэкспрессии или низкой экспрессии отдельных изоформ является лишь гипотезой. Изменение в уровне экспрессии может быть вызвано физиологическими причинами или различать­ся в клетках разной линии либо стадии дифференци­ровки. Фракция мононуклеарных клеток нормального костного мозга включает в себя различные типы кле­ток. Выявить патогенетическое значение аберрантной экспрессии какого-либо гена можно, лишь сравнивая здоровую группу с разными группами лейкозов. Срав­нение профиля экспрессии Ikaros в норме и патологии представлено на рис. 2.

Единицей измерения экспрессии служат относи­тельные единицы, указывающие уровень определяе­мой мишени относительно контрольного гена ABL (ген «домашнего хозяйства»). Таким образом, экспрессию разных мишеней можно сравнивать между собой. Для гена Ikaros в здоровом КМ явно преобладает экспрес­сия длинных, функциональных изоформ Ik1, Ik3, Ik2. Наиболее сильная экспрессия характерна для Ik2, что было показано нами на прежних этапах работы более грубым методом анализа в полиакриламидном геле. Выраженность этой изоформы в 2-4 раза превышает уровень контрольного гена.

Короткие, нефункциональные изоформы гена Ikaros - Ik4, Ik5, Ik6, Ik8 и Ik9 в здоровом костном мозге экс­прессируются на значительно более низком уровне - от 0,1-0,01 от контрольного гена и ниже. Самая короткая изоформа, Ik10, практически не экспрессируется во­обще. Несмотря на схожесть общего профиля между

донорами и пациентами с ОЛЛ у последних в части случаев наблюдается сверхэкспрессия отдельных изо­форм, в первую очередь коротких Ik6, Ik9, Ik10.

4. Сравнение экспрессии длинных изоформ Ikaros при ОЛЛ и в здоровом КМ

Сравнение экспрессии изоформ Ikaros пациентов с ОЛЛ с донорами КМ выполнялось методом непараме­трической статистики (Mann-Whitney U Test) (рис. 3). В лейкозных клетках уровень экспрессии длинных изо­форм был немного снижен, достоверно для Ik2 (p = 0,01). Это длинные, функциональные изоформы, содержащие функциональный ДНК-связывающий домен.

Интересно, но экспрессия коротких изоформ Ik4 (p = 0,006) и особенно Ik8 (p = 0,004) также снижена в опухолевых клетках по сравнению с контролем. Эта зависимость на первый взгляд противоречит исходной гипотезе об участии коротких изоформ в патогенезе ОЛЛ. Ik4 сохраняет экзон 4, содержащий два цинковых пальца. Ik8 не содержит ДНК связывающего домена вовсе и является определенно доминантно-негативной изоформой. Те же закономерности характерны и для групп В- и Т-линейного ОЛЛ.

5. Аберрантная экспрессия Ik6 и Ik9 при ОЛЛ

Среди всех изоформ гена Ikaros наибольшие от­клонения при ОЛЛ выявлены для самых коротких изо­форм - Ik6 и Ik9. Эти отклонения не затрагивают всю группу пациентов с ОЛЛ. Большинство лейкозов имеет примерно нормальный профиль экспрессии изоформ гена Ikaros с небольшими вариациями, обычно в сторо­ну снижения всех изоформ (репрессии транскрипции гена Ikaros). Но в отдельных случаях ОЛЛ наблюдается сверхэкспрессия на уровне, превышающем норму на 2-3 порядка.

Причина этого явления пока не ясна, но существенно, что это не статистическое количественное увеличение, а качественный признак. Поскольку анализ RQ-PCR все-таки является количественным, требуется установление критерия, отличающего сверхэкспрессию Ik6 от нормы. Для этого была построена точечная гистограмма распре­деления экспрессии Ik6 и Ik9 (рис. 4).

Медиана уровня Ik6 в лейкозных клетках соста­вила 0,041. Максимальное значение экспрессии Ik6 в костном мозге здоровых доноров - 0,151, медиана - 0,015. Таким образом, разделение по медиане, как это часто применяется для качественной оценки экспрес­сии генов, не подходит, так как планка будет занижена. Реалистичный порог сверхэкспрессии Ik6 превышает верхний возможный уровень в здоровом КМ. Исходя из распределения случаев в логарифмической шкале (рис. 4), было решено выбрать пороговым значение 0,2. С учетом этого критерия 24 из 116 образцов (20,7%) имели сверхэкспрессию Ik6.

В нормальных лимфоцитах костного мозга Ik9 экс­прессируется на уровне 0,007-0,025 (медиана 0,014). В лейкозных бластах Ik9 экспрессируется с большим разбросом значений, также как и Ik6, однако диапазон уровней и медиана Ik9 несколько ниже, чем для Ik6. Исходя из различий между контрольными группами и распределением уровня Ik9 в логарифмической шкале в общей группе пациентов с ОЛЛ (рис. 4), было решено выбрать в качестве порогового критерия значение 0,1. С учетом этого критерия 13 из 116 образцов (11,2%) ОЛЛ имели сверхэкспрессию Ik9. Все 13 случаев сверхэкспрессии Ik9 имели В-линейный фенотип ОЛЛ (13/85, 15,3%) и во всех этих случаях сверхэкспрессия Ik9 совпадала со сверхэкспрессией Ik6. Можно заклю­чить, что появление этих двух коротких изоформ при ОЛЛ определяется одним и тем же фактором.

В отличие от Ik6 и Ik9, которые имеют низкий фи­зиологический уровень экспрессии, самая короткая изоформа, Ik10, в норме практически не выявлялась. В одном случае нормального КМ зафиксирован уровень Ik10=0,0036. В связи с этим определение порогового уровня для сверхэкспрессии этой изоформы затруд­нено. В такой ситуации лейкоз оценивается как Ik10-позитивный в случае любой воспроизводимой ампли­фикации с характерной логистической формой кривой ранее 40 цикла с ?Ct в репликах (дуплете или триплете) ?2. Опираясь на такой технический критерий, мы при­знали Ik10-позитивными четыре случая ОЛЛ с уровнем значения Ik10 выше 0,1. Такой уровень, аналогичный Ik9, был выбран в качестве рабочего критерия для оценки статуса экспрессии Ik10 у пациентов с ОЛЛ.

6. Внутригенные делеции в локусе IKZF1

Согласно последним данным при ОЛЛ в гене IKZF1 (Ikaros) с относительно высокой частотой встречаются внутригенные делеции, ассоциированные с плохим прогнозом. Генетические поломки этого локуса при лейкозах разнообразные, но в большинстве случаев ОЛЛ сводятся к всего к двум доминирующим типам делеций - делеции, включающие 3-6 кодирующий экзон (4-7 экзон мРНК) и 1-6 кодирующий экзон (2-7 экзон мРНК) (рис. 5).

Анализ делеций в локусе IKZF1 выполнялся двумя методами: традиционной ПЦР и методом RQ-PCR. В изучаемой группе ОЛЛ был выполнен скрининг двух наиболее частых типов делеций в локусе IKZF1 - де­леции, включающие 3-6 кодирующий экзон (4-7 экзон мРНК) и 1-6 кодирующий экзон (2-7 экзон мРНК). Для этого использовались оба описанных выше метода - классическая ПЦР для всех образцов и RQ-PCR для сомнительных случаев, подтверждения данных элек­трофореза и при наличии сверхэкспрессии коротких изоформ Ikaros.

Делеция в локусе IKZF1 была выявлена у 26 из 172 пациентов с ОЛЛ (15%). В половине этих случаев деле­ция выявлялась методом RQ-PCR в минорных субпо­пуляциях лейкозных бластов (менее 1% клеток). За ис­ключением одного случая Т-ОЛЛ, в котором определя­лась делеция IKZF1 методом RQ-PCR на уровне 10-4, делеции были характерны для В-линейного ОЛЛ и со­ставляли 25 из 147 (17%) этой группы.

В 25 из 26 случаев ОЛЛ была выявлена делеция ΔEx3-6, в трех случаях делеция ΔEx1-6 (у двух пациентов обнаружены две делеции одновременно). В одном случае ОЛЛ делеция ΔEx1-6 обнаруживалсь в субклоне. У одного пациента П-к делеция ΔEx1-6 была выявлена при первичном диагнозе и ей сопутствовала также делеция ΔEx3-6. Примечательно, что при рецидиве заболевания у этого пациента делеция ΔEx1-6 не выявлялась, а делеция ΔEx3-6 присутствовала, но как показал анализ нуклеотидной последовательности, иная, чем при первичном диагнозе. Это говорит о том, что две или все три делеции происходят из разных клонов лейкозных клеток. О биаллельных и олигоклональных делециях IKZF1 уже сообщалось ранее.

7. Связь между делециями в локусе IKZF1 и аберрантным сплайсингом Ikaros

Мы проанализировали соотношения между делециями в гене IKZF1 и экспрессией коротких изоформ гена Ikaros. Высказаны две гипотезы возникновения аберрантной экспрессии коротких изоформ гена Ikaros. Согласно первой, F. Klein et al., такой альтернативный сплайсинг является результатом эпигенетического воздействия, в т. ч. вызванного биохимическими эффектами химерного онкогена BCR/ABL. Другой точки зрения придерживается проф. C. Mullighan et аl., указывая единственной причиной аберрантного сплайсинга наличие делеций в гене.

Всего 115 пациентов с ОЛЛ были проанализированы на уровне ДНК на наличие генных делеций и на уровне РНК на экспрессию коротких изоформ гена Ikaros. Полученные результаты представлены в табл.

Примечание: субклон означает наличие делеции в минорных субклонах опухолевых клеток

Как видно из таблицы, наличие делеции в локусе IKZF1 сильно ассоциировано со сверхэкспрессией ко­ротких изоформ (p<0,0001, Chi-квадрат). В отсутствии делеции только у 9 из 93 обследованных с ОЛЛ (9,7%) встречалась сверхэкспрессия Ik-DN, причем в 7 случа­ях это была только экспрессия Ik6, а еще в 2 случаях - сверхэкспрессия Ik6 и Ik9. При наличии делеции, из 10 пациентов с ОЛЛ была сверхэкспрессия у 7 - Ik6 и Ik9, еще у 3 пациентов - еще и Ik10. В случаях ОЛЛ с делецией в минорных субклонах опухолевых клеток была промежуточная ситуация - в 6 случаях был нор­мальный профиль экспрессии Ikaros, в 6 - сверхэк­спрессия Ik-DN.

Нами были проанализированы различия в количе­ственном уровне экспрессии отдельных изоформ гена Ikaros в группах ОЛЛ с наличием и отсутствием деле­ции (рис. 6). Экспрессия длинных изоформ Ikaros была несколько снижена при наличии делеции (достоверно для Ik1 и Ik4). Ik8 также был несколько снижен при де­леции, что вновь характеризует Ik8 как физиологиче­скую изоформу. При этом сверхэкспрессия коротких изоформ очень сильно коррелировала с наличием де­леций. Это справедливо в равной степени для Ik6, 9, 10.

Таким образом, можно заключить, что фенотипиче­ские проявления делеций в гене Ikaros, вызванные де­лециями в его локусе, связаны не с падением экспрес­сии гена в целом (длинных изоформ), а именно сверх­экспрессии коротких изоформ. Однако вопрос о при­чинах и механизмах аберрантного сплайсинга в отсут­ствии делеций остается открытым.

Была разработана панель праймеров и флуорес­центно меченных TaqMan-зондов, позволяющая из­мерять с помощью метода RQ-PCR экспрессию 9 изо­форм гена Ikaros. Дизайн исследования был оптими­зирован и унифицирован всего для 2 зондов. Первый, Ex4_TM, меченный флуоресцентной меткой JOE, при­менялся для определения изоформ Ik1, Ik3, Ik2, Ik4. Второй, Ex7-5’TM, меченный флуоресцентной меткой ROX, применялся для выявления коротких изоформ Ik5, Ik8, Ik6, Ik9, Ik10.

В лейкозных клетках профиль экспрессии изоформ гена Ikaros в большинстве случаев сходен с таковым для нормального костного мозга. При этом отмечено некоторое уменьшение уровня экспрессии изоформ гена Ikaros относительно здорового костного мозга. В лейкозных клетках достоверно снижена экспрессия Ik2, Ik4 и Ik8.

Аберрантная сверхэкспрессия изоформ Ik6, Ik9, Ik10 была выявлена в 24, 11 и 4 случаев ОЛЛ соответ­ственно. Это основное качественное изменение в экс­прессии гена Ikaros, обнаруженное главным образом при В-линейном ОЛЛ (30%). Во всех случаях сверх­экспрессия изоформы Ik9 или Ik10 сопутствовала Ik6, что говорит об их сцепленном характере регуляции этих изоформ. В 9 из 25 случаев Ik-DNлейкозов сверхэк­спрессия Ik6 была единственной короткой изоформой.

Делеция в локусе IKZF1 была выявлена у 26 из 172 пациентов с ОЛЛ (15%). В половине этих случа­ев делеция выявлялась методом RQ-PCR в минорных субпопуляциях лейкозных бластов (менее 1% клеток). За исключением одного случая Т-ОЛЛ делеции были характерны для В-линейного ОЛЛ и составляли 25 из 147 (17%) в этой группе. В 25 из 26 случаев ОЛЛ была выявлена делеция ΔEx3-6, в трех случаях делеция ΔEx1-6.

Примечательно, что мутации IKZF1 часто охва­тывают не всю субпопуляцию лейкозных клеток, но возникают в субпопуляциях лейкозных клеток. Это указывает на то, что аберрации IKZF1 не являются инициальными, патогенетическими событиями, а воз­никают в ходе прогрессии заболевания как вторич­ные события. Это подтверждается также нестрогим наследованием аберраций IKZF1 в парных случаях первичный - рецидив или первый и второй рецидив. Отмечены случаи, когда делеции IKZF1 или сверхэк­спрессия Ik-DN изоформ пропадали или появлялись при рецидиве заболевания.

Сверхэкспрессия Ik-DN изоформ является основным проявлением нарушений в гене IKZF1 при лейкозах на уровне транскрипции и сплайсинга. По нашим данным, сверхэкспрессия Ik-DN сильно ассоциирована с наличием внутригенных делеций в локусе IKZF1. Подтверждается, что делеция 3-6 экзонов этого гена, соответствующих ДНК-связывающему домену белка Ikaros, приводит к сплайсингу оставшихся экзонов с образованием Ik6, Ik9, Ik10. Однако эти изоформы об­наруживались и в некоторых случаях ОЛЛ без деле­ции. Можно допустить, что у этих пациентов были де­леции IKZF1, не выявляемые используемыми метода­ми или что какие-то другие мутации или эпигенети­ческие факторы приводят к сверхэкспрессии Ik-DN изоформ