Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) - это гете­рогенное заболевание, которое классифицируется на основании наличия специфических цитогенетических аномалий, т. е. согласно Франко-Америко-Британской (FAB) классификации лейкемических клеток и имму­нофенотипов. Одна из наиболее часто идентифицируе­мых в случаях лейкемии транслокаций располагается между хромосомными сегментами 8q22 и 21q22. Такая транслокация ассоциирована примерно в 40% случаев FAB-M2 ОМЛ и в 8-20% всех случаев ОМЛ в зависи­мости от генетических предпосылок и географии по­пуляции. Транслокация (8;21) также наблюдается при­мерно в 6% случаев ОМЛ М1 и гораздо реже в ОМЛ М0, М4, М5 и других миелоидных неоплазиях. Хотя для взрослых пациентов транслокация (8;21) является маркером, указывающим на более благоприятный про­гноз, для детей вероятность долгосрочной ремиссии составляет около 30%.

Несмотря на обширные данные литературы, на се­годняшний день нет четкого представления о много­образии РНК-продуктов гибридного онкогена AML1/ETO в клетках ОМЛ и их функциональной значимости при ОМЛ. Кроме того, до конца не ясна прогностиче­ская значимость уровня экспрессии гибридного онко­гена AML1/ETO и индивидуального спектра его РНК-продуктов для пациентов, больных ОМЛ с транслока­цией t(8;21)(q22;q22).

Исходя из вышесказанного, нами была сформули­рована следующая цель - изучить спектр альтернатив­ных форм сплайсинга пре-мРНК гибридного онкогена AML1/ETO в лейкозных клетках пациентов, больных ОМЛ, содержащих транслокацию t(8;21)(q22;q22), на протяжении курса терапии.

Первой задачей, стоявшей перед нами в ходе данно­го исследования, была экспериментальная верифика­ция альтернативных точек терминации транскрипции гибридного гена RUNX1/RUNX1T1 с помощью специ­фических обратных праймеров в клетках острого мие­лоидного лейкоза, содержащих транслокацию t(8;21)(q22;q22).

На данном этапе экспериментальной верификации предсказаний новой описательной биоинформационной модели гибридного гена RUNX1/RUNX1T1 мы сосре­доточились на четырех областях предполагаемой тер­минации транскрипции, идентифицированных путем анализа полноразмерных кДНК гена RUNX1T1 из баз данных GenBank и dbEST. Эти области соответствуют3’UTR-экзонам 12а(6а), 15а(9а), 17а(11а) и 17 гена RUNX1T1. Наличие в клетках положительной по транслокации t(8;21)(q22;q22) формы острого миело­идного лейкоза транскриптов гибридного гена RUNX1/RUNX1T1, терминированных по указанным экзонам, подтверждалось с помощью ПЦР. В качестве матри­цы для ПЦР использовалась кДНК, полученная с по­мощью реакции обратной транскрипции тотальной РНК из лейкозных клеток. Затравками в ПЦР служили пары праймеров, одним из которых был прямой прай­мер RUNX1-exon 6_FP, направленный к экзону 6 гена RUNX1, а вторым - один из обратных праймеров, на­правленных к указанным выше областям предполагае­мой терминации транскрипции. Характеристика всех использованных на данном этапе работы праймеров представлена в табл. 1.

Ген RUNX1T1 человека транскрибируется с антисмысловой цепи. Область этого гена, вовлеченная в рекомбинационные события при транслокации t(8;21)(q22;q22), взята в пунктирный прямоугольник. Все потенциальные сайты терминации транскрипции, которые могут входить в состав гибридного гена RUNX1/RUNX1T1, распо­лагаются слева от рекомбинационной области

ПЦР была остановлена в фазе плато (30-й цикл амплификации). Один микролитр каждой пробы был проанализирован на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer с использованием набора реагентов Agilent DNA 7500 Kit (Agilent Technologies GmbH, Германия). Дорожка 1: амплификация с парой праймеров RUNX1-exon 6_FP и RUNX1T1-exon 12a(6a)_RP. Дорожка 2: амплификация с парой праймеров RUNX1-exon 6_FP и RUNX1T1-exon 15a(9a)_RP. Дорожка 3: амплификация с парой праймеров RUNX1-exon 6_FP и RUNX1T1-exon 17a(11a)(v.1)_RP. Дорожка 4: амплификация с парой праймеров RUNX1-exon 6_FP и RUNX1T1-exon 17(v.1)_RP

Как это показано на рис. 2, продукты амплифика­ции были разделены с помощью полиакриламидно­го гель-электрофореза, элюированы и секвенированы. Для всех изученных потенциальных областей термина­ции транскрипции гибридного гена RUNX1/RUNX1T1 было подтверждено наличие специфических РНК-продуктов. При этом нами пока не обнаружено включе­ние 3’UTR-экзонов 12а(6а), 15а(9а), 17а(11а) и 17 гена RUNX1T1 в качестве внутренних экзонов в состав ги­бридной РНК.

Таким образом, при транскрипции гибридного гена RUNX1/RUNX1T1 помимо канонической области тер­минации в районе 3’UTR-экзона 17 гена RUNX1T1 мо­гут использоваться еще как минимум три области для прекращения транскрипции - в районе 3’UTR-экзонов 12а(6а), 15а(9а) и 17а(11а). Без сомнения, благодаря этим дополнительным областям терминации должен расшириться репертуар РНК-транскриптов гибридного гена.

Следовательно, нами было принято решение бо­лее глубоко изучить соотношение AE, AE6a и AE9a, AE17, AE17a РНК-транскриптов гибридного онкогена RUNX1/RUNX1T1 в клетках пациентов с ОМЛ с транс­локацией t(8;21)(q22;q22) до начала и после заверше­ния курса терапии. На данный момент, для гибридно­го онкогена RUNX1/RUNX1T1 описано огромное разно­образие альтернативных транскриптов. Влияние пол­норазмерного транскрипта AE и продукта его экспрес­сии на процесс патогенеза ОМЛ уже достаточно хо­рошо изучено, чего нельзя сказать об альтернативных изоформах. Несмотря на это в последнее время наблю­дается существенный прогресс в понимании механиз­мов, посредством которых данные транскрипты влия­ют на процесс лейкемогенеза. Одними из таких транс­криптов являются AE6a и AE9а (рис. 3).

Как видно из приведенного рис., транскрипты AE6a и AE9a не включают в свой состав последовательно­сти, кодирующие ряд ключевых для гибридного онко­гена RUNX1/RUNX1T1 белковых доменов. Несмотря на этот факт для обеих изоформ получены предваритель­ные данные, свидетельствующие в пользу их важно­сти в процессе лейкемогенеза. Согласно эксперимен­тальным данным, полученным на мышиных моделях, транскрипт, включающий экзон 6а, увеличивает кло­ногенный потенциал клеток, позитивных по t(8;21)(q22;q22). Наличие транскрипта, включающего экзон 9а, способствует более быстрому развитию лейкоза с блоком дифференцировки клеток на более ранних ста­диях, а также, предположительно, более вероятному рецидиву.

Таким образом, основываясь на описанных выше результатах исследований, мы поставили перед собой задачу изучить особенности экспрессии данных транс­крипционных вариантов AE6a, AE9a, AE17a, AE17 ги­бридного онкогена RUNX1/RUNX1T1 в группе пациен­тов с ОМЛ, позитивных по транслокации t(8;21).

Для предварительной оценки экспрессии транс­крипционных вариантов AE, AE6a и AE9а гибридно­го онкогена RUNX1/RUNX1T1 в образцах пациентов с ОМЛ, позитивных по транслокации t(8;21), нами были отобраны двенадцать соответствующих случаев (табл. 2).

Для каждого пациента анализ проводился в двух точках: на момент постановки диагноза и в состоянии ремиссии. Оценка экспрессии анализируемых изоформ проводилась методом ПЦР на кДНК пациентов. В ка­честве прямого праймера использовался праймер к 6 экзону гена RUNX1, в качестве обратного для полного транскрипта AE - праймер к 17 экзону гена RUNX1T1, для транскрипта AE6a - к 6а экзону гена RUNX1T1, для транскрипта 9а - к 9а экзону гена RUNX1T1, для транс­крипта 17а - к 17а экзону гена RUNX1T1 (табл. 3).

После того, как нами были идентифицированы наи­более вероятные области терминации транскрипции, отработанный для модельной клеточной линии Kasumi 1 подход (рис. 2) мы применили для анализа спектра альтернативных форм сплайсинга пре-мРНК гибридно­го онкогена RUNX1/RUNX1T1 в лейкозных клетках 12 пациентов с ОМЛ, содержащих транслокацию t(8;21)(q22;q22), на протяжении курса терапии.

Полученные в результате проведенных ПЦР фраг­менты были очищены в полиакриламидном геле и идентифицированы с помощью секвенирования. В ре­зультате для каждого пациента нами был получен про­филь возможных транскриптов, на момент постановки диагноза и по достижении ремиссии оканчивающихся на экзоны 6а, 9а, 17, 17а (табл. 4).

Для всех пациентов наблюдалась амплификация фрагмента полноразмерного транскрипта АЕ как в ма­териале, взятом на момент постановки диагноза, так и в период, когда пациент находился в клинической и мор­фологической ремиссии. Полученные результаты со­гласуются с данными литературы. Неоднократно опи­саны случаи обнаружения химерного онкогена RUNX1/RUNX1T1 методом ОТ-ПЦР в образцах пациентов, нахо­дящихся в длительной цитогенетической и морфологиче­ской ремиссии.

Транскрипты, оканчивающиеся на экзон 17а, не были обнаружены ни в одном из образцов. Лишь для модель­ной клеточной линии наблюдалась амплификация фраг­мента транскрипта AE17a. Вероятно, включение экзона 17a в транскрипты химерного онкогена RUNX1/RUNX1T1 является достаточно редким событием, если учесть, что согласно нашим данным, он наблюдался лишь в 1 из 13 образцов.

Фрагменты транскриптов с экзоном 6а в нашем ис­следовании наблюдались у большей части пациентов как в первичных образцах, так и в материале, взятом на мо­мент ремиссии. Интересно отметить в трех случаях: 1, 3 и 6 транскрипты, содержащие данный экзон, обнаружи­вались лишь в ремиссии. Согласно данным литературы, включение экзона 6а в транскрипты химерного онкоге­на RUNX1/RUNX1T1 увеличивает клоногенный потенци­ал клеток.

Транскрипты, оканчивающиеся на экзон 9а, обнару­живались в образцах всех 12 пациентов на момент поста­новки диагноза. Проведенные ранее исследования пока­зали, что в группе пациентов, в образцах которых обнару­живались транскрипты данного типа, риск рецидива по­вышен по отношению к группе без данного типа транс­криптов. В нашей группе подобной корреляции не наблю­далось, так как все 12 пациентов, включенных в исследо­вание, находятся в ремиссии, и ни у одного не наблюда­лось рецидивов. Можно предполагать, что подобные раз­личия в результатах между нашими исследованиями и ра­нее опубликованными данными были получены по при­чине разницы в чувствительности подходов. Вероятно, что используемый нами подход является более чувстви­тельным и с большей вероятностью обнаруживает транс­крипты, представленные в клетке в очень небольшом ко­личестве.

Достижения Таким образом, можно предположить, что не толь­ко наличие транскриптов, оканчивающихся на экзоны 6а и 9а гена RUNX1T1, но и их количество играет опреде­ленную роль в дальнейшем течении заболевания. Сле­довательно, дальнейшее изучение спектра альтернатив­ных форм сплайсинга пре-мРНК гибридного онкогена AML1/ETO методами количественной ПЦР позволят уточнить прогностическую значимость обнаруженных нами вариантов транскриптов. Данные количественных исследований также лягут в основу модифициро­ванного варианта метода диагностики минимальной остаточной болезни у прошедших курс лечения паци­ентов с ОМЛ, положительным по транслокации t(8;21)(q22;q22).­

Новизна: изучен спектр альтернативных форм сплайсинга пре-мРНК гибридного онкогена RUNX1/RUNX1T1 в лейкозных клетках пациентов, больных ОМЛ, содержащих транслокацию t(8;21)(q22;q22), на протяжении курса терапии и в состоянии ремиссии.