Neisseria meningitidis является одной из главных причин септицемии и менингита во всем мире: слу­чаи менингококковой инфекции регистрируются по­всеместно и составляют 1-3 на 100 тыс. населения в развитых и 10-25 на 100 тыс. в развивающихся стра­нах. Заболеваемость менингококковым менингитом (и менингококкцемией) в Беларуси составила 1,3 на 100 тыс. в 2011 г. и 1,2 на 100 тыс. в 2012 г. Более 70% слу­чаев составили пациенты в возрасте до 2 лет, смерт­ность - 9,5-11%. Основная группа риска - дети до 14 лет.

Серогруппы менингококка А, В, С, Y и W135 от­ветственны более чем за 90% случаев менингококко­вого менингита (и менингококкцемии) в мире. В Бе­ларуси мажорными серогруппами являются А (11%), В (42%), С (13%), также встречаются нетипируемые штаммы и штаммы минорных серогрупп Y, W135, 29E, X.

Цель - разработка метода мультиплексной ПЦР для определения основных клинически значимых серогрупп N. meningitidis (А, В, С, Y, W135 и 29E) и апробация данного метода. Материалом для исследо­ваний послужили 56 образцов ДНК менингококков (серогрупп А, В, С, Y, W135), выделенных от пациен­тов, контактных лиц и бактерионосителей в различ­ных регионах страны в 2011-2013 гг. Также в работе использовались следующие контрольные штаммы ме­нингококка: ATCC 13077 N. meningitidis (serogroup A), NCTC 10026 N. meningitidis (serogroup B), ATCC 13102 N. meningitidis (serogroup C), NCTC 11202 N. meningitidis (serogroup 29E) NCTC 11203 N. meningitidis (serogroup W135), ATCC 35561 N. meningitidis (serogroup Y).

Для серогруппового определения методом муль­типлексной ПЦР были отобраны 6 пар праймеров, которые сгруппированы в две смеси по три пары праймеров каждая: смесь A-B-Y (mynA(А), siaD(B), siaD(Y) и смесь C-W135-29E (siaD(C), synG(W135), cap29EH(29E). Каждая смесь амплифицировалась в от­дельной пробирке - две реакции на одну пробу.

Концентрации и состав компонентов реакционной смеси в ПЦР для определения серогрупп менингокок­ков: конечная концентрация каждого праймера 10 пМ/мкл, Taq полимераза (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, 10?ПЦР бу­фер с (NH4)2SO4 - 2,5 мкл, смесь нуклеотидов (dNTP Mix) (10 мМ) - 0,5 мкл, раствор MgCl2 (25 мМ) - 2 мкл, раствор ДНК - 1-10 мкл, вода добавляется в объеме, необходимом до доведения общего объема ре­акционной смеси до 25 мкл.

Условия амплификации для каждой реакции (смеси) унифицированы: первичная денатурация 95°С - 5 мин, 35 циклов: 95°C - 60 с, 55°C - 40 с и 72°C - 30 с, финальная элонгация 72°C - 10 мин.

Пример результатов постановки мультиплексной ПЦР с шести серогруппами N. meningitidis: А, В, С, Y, W135 и 29E (рисунок).

Рис. Электрофореграмма результата постановки мультиплексной ПЦР с шести серогруппами N. meningitidis: лунки 1-4 - смесь C-W135-29E: лунка 1 - трицательный контроль смеси C-W135-29E, лунка 2 - ампликон гена cap29EH(29E), 694 п.н., лунка 3 - ампликон гена siaD(C), 250 п.н., лунка 4 - ам­пликон гена synG(W135), 476 п.н.; лунка 5 - маркер мо­лекулярного веса (100-1500 п.н.); лунки 6-9 -смесь A-B-Y: лунка 6 - ампликон гена siaD(Y), 120 п.н., лунка 7 - ампликон гена siaD(B), 450 п.н., лунка 8 - ампликон гена mynA(А), 349 п.н., лунка 9 - отрицательный контроль смеси A-B-Y)

При оценке чувствительности мультиплекс­ной ПЦР оценивали чувствительность каждой пары праймеров по реакции с ГЭ/мл. ДНК менин­гококка определенной серогруппы в диапазоне 101-106 ГЭ/мл. Чувствительность реакций варьиро­вала от 102-103 ГЭ/мл: 102 ГЭ/мл - для праймеров siaD(Y), siaD(C), mynA(А), 103 ГЭ/мл - для прайме­ров cap29EH(29E), synG(W135), siaD(B). Чувствитель­ность метода мультиплексной ПЦР принята равной 103 ГЭ/мл.

Проведено серотипирование 56 изолятов менин­гококков (серогрупп А, В, С, Y, W135), выделенных от пациентов, контактных лиц и бактерионосителей, поступивших в РНПЦ эпидемиологии и микробио­логии из различных областей Беларуси в 2011-2013 гг. Все культуры (n = 56) менингококка успешно се­ротипированы данным методом: 47 культур (84%) - серогруппа В, 4 (7%) - серогруппа С, 3 (5%) - се­рогруппа А, 1 (2%) - серогруппа Y, 1 (2%) - серо­группа W135.

Выводы:

1. Разработан метод мультиплексной диагностиче­ской ПЦР для определения шести мажорных серогрупп N. meningitidis: А, В, С, Y, W135 и 29E, условия ампли­фикации и концентрации реагентов для удобства мето­да унифицированы. Чувствительность метода состави­ла 103 ГЭ/мл.

2. Проведена апробация метода на 56 изолятах менингококков (серогрупп А, В, С, Y, W135), выде­ленных от пациентов, контактных лиц и бактерионо­сителей в различных регионах Беларуси в 2011-2013 гг.: 47 культур (84%) - серогруппа В, 4 (7%) - се­рогруппа С, 3 (5%) - серогруппа А, 1 (2%) - серо­группа Y, 1 (2%) - серогруппа W135. Таким обра­зом, метод может быть рекомендован в качестве аль­тернативы методу латекс-агглютинации (с преиму­ществом отсутствия нетипируемых штаммов данных серогрупп).

3. На основе данного метода разработана тест-система для определения серогрупп Neisseria meningitidis.