Постановка клинического диагноза прионного за­болевания для специалистов практического здраво­охранения остается весьма сложной проблемой, а его верификация осуществляется только на аутопсийном материале посмертно. Серологическая диагностика бо­лезней ограничена отсутствием воспалительных реак­ций и иммунного ответа на инфекцию. Прижизненная диагностика также не разработана. Отсюда выявляе­мость пациентов с прионными инфекциями в респу­блике находится на весьма низком уровне. Речь идет лишь о случайных находках. Не исключено, что такие пациенты существуют и проходят под другими диагно­зами, например, болезнь Альцгеймера, Паркинсона, дисциркуляторная энцефалопатия II-III степени, муль­тисистемная атрофия, высокая форма бокового амио­трофического склероза, множественный склероз и др.

Цель - разработать и апробировать способ детек­ции патологической формы прионного белка в аутоп­сийном и биопсийном материале от пациентов с деге­неративным поражением нервной системы для диф­ференцирования «инфекционных амилоидозов» (при­онные инфекции) от других органических, включая симптоматические и психические, расстройств (F0 МКБ-10).

Для визуализации и идентификации аномального протеазоустойчивого прионного белка PrP27-30, кор­релята инфекционности при прионных болезнях, в материале от пациентов с различной нейродегенера­тивной патологией нами применен нанотехнологиче­ский подход, заключающийся в реализации условий концентрирования искомых патологических прион­ных белков на заданных участках твердой поверхно­сти гидрофильного кремния («иммуночипе») с нане­сенными микроконтактной печатью (МКП) полосками из бычьего сывороточного альбумина (БСА) и активи­рованной специфическими анти-PrP моноклональны­ми антителами (МАТ) с последующей визуализацией результатов анализа методом атомно-силовой микро­скопии (АСМ). АСМ-изображения поверхности «им­муночипов» до и после взаимодействия с анализиру­емыми образцами получали на воздухе с помощью ми­кроскопа Nanoscope IIIa (Veeco, США), оборудованно­го «D-сканером» в контактном режиме (contact mode) или в режиме прерывистого контакта (tapping mode). Использовали контактные 100- и 200-мкм кантилеве­ры «Nanoprobe» из Si3N4 с константой упругости 0.12 и 0.36 N/m и тейпинговые иглы из кремния с резонанс­ной частотой ~315 кГц. Сила воздействия иглы на об­разец в контактном режиме составляла единицы нН. При получении изображения варьировали частотой строчной развертки от 1 до 5 Гц. Все образцы проходи­ли одинаковые этапы пробоподготовки. Для обеспече­ния достоверности результатов образцы исследовали в 4-кратной повторности.

В качестве клинического материала использова­ли общий пул лейкоцитов из периферической кро­ви (ЛПК), спинномозговую жидкость (СМЖ) и аутоп­сии мозга (АМ), полученные от пациентов с установ­ленным/предполагаемым постмортальным или кли­ническим диагнозом болезнь Альцгеймера (6), Крейт­цфельдта-Якоба (2), амиотрофический лейкоспонги­оз (2), сосудистая деменция (1), и с другими прогрес­сирующими нейродегенеративными болезнями неуста­новленной этиологии (8). Положительным контролем служили ЛПК и АМ золотистых сирийских хомяков с экспериментальной инфекцией скрепи, штамм 263 К (по 3); отрицательным - ЛПК здоровых доноров (10), ЛПК и АМ интактных животных (по 2).

Высокую концентрацию PrP27-30 из положитель­ных образцов, обработанных протеиназой К (100 мкг/мл, 2 ч, 37°С) при последующей адсорбции их на по­верхности «иммуночипа» порядка 100х100 мкм (что более чем достаточно для исследований с помощью АСМ), обеспечивает специфичность взаимодействия протеазоустойчивого прионного белка с МАТ, напри­мер, с анти-PrP 3F4, 6H4 и др. При этом полосы БСА служат поверхностями сравнения для оценки высот анализируемых биообъектов.

Было показано, что в условиях эксперимента ши­рина полос БСА при МКП составила 1,7±0,2 нм, а пе­репад высот БСА и немодифицированной поверхно­сти кремния - в среднем 1,66±0,2 нм. Уровень полос МАТ, иммобилизованных в промежутки между полоса­ми БСА, был лишь незначительно ниже уровня полос БСА (~ на 0,1 нм). После взаимодействия МАТ с PrP27-30 на поверхности «иммуночипов» выявляли узкие по­лосы белковых комплексов шириной 1,3±0,2 нм, пре­вышающие уровень полос БСА в среднем на 1,6±0,2 нм. Отсюда можно рассчитать, что в условиях экспери­мента высота комплекса «МАТ+PrP27-30» составляла в среднем 3,2±0,4 нм. В АСМ-изображениях отрицатель­ных образцов, не содержащих патологический прион­ный белок, после протеолитической обработки и взаи­модействия с МАТ выраженных различий уровнях по­лос БСА и МАТ не отмечено.

При апробации предложенного способа наивысший положительный сигнал при АСМ-детекции специфи­ческих комплексов МАТ+PrP27-30 отмечен при анали­зе ЛПК, СМЖ и АМ пациентов с БКЯи АЛ (100% по­ложительных результатов). Результаты коррелировали с данными АСМ-анализа ЛПК и АМ положительных контрольных образцов лабораторных животных с экс­периментальным скрепи. В ЛПК 2 пациентов с диагно­зами органический амнестический синдром (F04 МКБ-10) и 1 пациента с конверсионным расстройством мо­торики (F44.4 МКБ-10) также получен положительный результат. В других клинических образцах (у здоровых доноров и интактных животных) образование специ­фических комплексов не выявлено.

Таким образом, использование сочетания АСМ с локальной активацией кремневой поверхности спец­ифическими анти-PrP антителами позволяет произво­дить управляемую фиксацию PrP27-30 из анализируе­мого образца на микронных участках поверхности им­муночипа, что может быть использовано для совершен­ствования исследований этиопатогенеза прионных бо­лезней, в т. ч. развития методов прижизненной диагно­стики прионных инфекций у человека.

На способ обнаружения аномальной протеазоу­стойчивой формы прионного белка (PrPd) при транс­миссивных губкообразных энцефалопатиях челове­ка и животных подана заявка на патент от 04.01.2011 г. № а20110013.