УДК: 57.082.4:578.7
Год издания: 2013

Технология культивирования особо опасных вирусов для сохранения коллекции

Красько А.Г.Рустамова Л.М.Семенов С.Ф.Богданова Н.Л.
Рубрики: 76.03.4176.03.43
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Разработать и внедрить современные технологии, направленные на создание и сохранение коллекции микроорганизмов, патогенных для человека и животных».
Сроки выполнения НИР: январь 2011 г. — декабрь 2013 г.
Научный руководитель: канд. мед. наук, доц. А.Г. Красько.
Источник финансирования: госбюджет.

В связи с нарастающим антропогенным воздей­ствием на природу, представляется необходимым не только изучение биоразнообразия микроорганизмов на всех уровнях - видовом, популяционном, клеточном и т. д., но и разработка методов его сохранения.

Эволюционные процессы, происходящие в микроб­ных популяциях, приводят к ухудшению экологической ситуации. Это объясняется следующими факторами:

• особенностями природных условий нашей страны (наличие лесов, озер, болот), что приводит к распростра­нению природно-очаговых заболеваний (клещевой энце­фалит, ЛХМ, ГЛПС, болезнь Лайма, бешенство и т. д.);

• прохождение через территорию страны путей ми­грации различных видов птиц создает условия для по­явления экзотических для страны возбудителей заболе­ваний: вируса Западного Нила и т. д.;

• географическое положение страны - центр Евро­пы, на перекрестке миграционных потоков населения, а также изменения в социальном поведении людей соз­дает условия для расширения списка возбудителей ин­фекционных заболеваний человека.

В практическом плане для контроля над ситуацией важная роль принадлежит работам по сбору и сохране­нию патогенных микроорганизмов и созданию коллек­ции национального уровня, которая располагает куль­турами патогенных микроорганизмов, циркулирующих в природе. Методология коллекционирования патоген­ных микроорганизмов во многом определяет результа­ты последующих этапов решения научных и практи­ческих вопросов в инфектологии. В теории и практи­ке коллекционирования патогенных микроорганизмов очень важно определить методы выделения и поддер­жания микроорганизмов для сохранения их природно­го разнообразия.

В технологии культивирования особо опасных ви­русов нами определены следующие моменты. Исхо­дным материалом для восстановления вирусов 1-2 групп патогенности явились либо 10% суспензия ин­фицированной ткани мозга белых мышей в растворе Хенкса, осветленная центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, либо культуральная вирус­содержащая жидкость. Это должен быть генетически однородный материал с точной историей пасса­жей. Для культивирования вирусов использовали пе­ревиваемые клеточные линии: почки африканской зе­леной мартышки - Vero, Vero Е6; почки эмбриона свиньи - СПЭВ, выращенные в пластиковых матра­цах (Sigma, USA). В качестве поддерживающей при­меняли среду MEM (Sigma, USA), содержащую 10 мМ HEPES; 0,075% NaHCО3; 2% эмбриональной телячьей сыворотки, прогретой при 56°С в течение 30 мин и 100 мкг/мл гентамицина-сульфата. Учитывая основные за­кономерности репродукции вирусов в клеточных лини­ях, для восстановления и накопления вирусного мате­риала подбирали наиболее подходящую линию клеток и низкую множественность инфицирования вирусами, порядка 0,1-0,01 БОЕ/кл. Исследования выполнены с арена- и филовирусами: Ласса (штамм Josiah), ЛХМ (штамм W54), Марбург (штамм Воедж), Эбола (штамм Заир), резистентным штаммом вируса Ласса; альфа- и флавивирусами: клещевого энцефалита (КЭ) (штамм 2140), Западного Нила (ЗН) (штамм 48-ЗН (Тремля)), денге I и III типа, венесуэльского энцефаломиелита ло­шадей (ВЭЛ) (штамм 230), в серии экспериментов in vitro в которых происходит эффективное размножение и накопление вирусного материала. Зараженные виру­сами клеточные линии инкубировали при 37°С. Мак­симальные величины титров вирусов выявлены на 3-4-е сут экспозиции для вирусов Ласса и ЛХМ и 5-7-е сут экспозиции для вирусов Марбург и Эбола. Нами опре­делена инфекционная активность вирусного материа­ла по способности формировать негативные колонии (бляшки) под агарозным покрытием (S-признак). При размножении вирусов Ласса и ЛХМ негативные ко­лонии достигали в размере 1-1,5 мм и появлялись на 5-6-е сут. Вирусы Эбола и Марбург при размножении в культурах клеток Vero Е6 формировали бляшки от 0,7-1 мм, которые появлялись на 6-7-е сут. Подтверждение подлинности восстановленных после хранения штам­мов вирусов оценивали с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции с контрольными иммунными сыворотками пациентов, содержащими антитела к вос­становленным вирусам, любезно предоставленные док­тором McCormik. По литературным данным, большин­ство альфавирусов в течение 2-х сут дают выраженное ЦПД. При заражении флавивирусами ЦПД обычно раз­вивается медленнее, начиная с третьего или четвертого дня после заражения клеточных культур. В наших иссле­дованиях при инфицировании 24-часовой культур кле­ток СПЭВ и Vero Е6 наблюдали выраженный цитопати­ческий эффект только вируса ВЭЛ.

При инфицировании клеток СПЭВ и Vero Е6 виру­сами КЭ, ЗН, денге III типа цитопатических проявле­ний в культуре клеток не наблюдали, однако, наличие репродуцирующегося вируса КЭ и ЗН в культуре кле­ток подтверждали с помощью реакции непрямой имму­нофлуоресценции или выявлением РНК при постанов­ке ПЦР со специфическими праймерами.

В культуральной жидкости определяли инфекцион­ную активность вирусов методом бляшек под агарозным покрытием на монослое клеток Vero Е6. При получении исходного вирусного материала для коллекции прово­дили 2-3 пассажа вирусов в пермиссивных клеточных линиях. При этом инфекционная активность достигала 5-7 lg БОЕ/мл, что является достаточным для последу­ющей лиофилизации и длительного хранения. Наиболее оптимальными режимами хранения вируссодержащего материала признано хранение при низких температурах (-20°С, -70°С), а жидком азоте, лиофильно высушенны­ми. Способы хранения подбирали индивидуально с уче­том особенностей вирусного материала.

Полученные результаты с полной уверенностью по­казывают, что сформированная устойчивая оптималь­ная схема функционирования коллекции должна вклю­чать в себя все необходимые элементы, гарантирую­щие поддержание в жизнеспособном состоянии куль­туры патогенных микроорганизмов.

Все коллекционные работы по освежению культур микроорганизмов проводились поэтапно в изолирован­ных боксах, исключающих внесение посторонних воз­будителей. Разработанный алгоритм коллекционирова­ния особо опасных вирусов направлен на сохранение исходных биологических свойств у поддерживаемых в лабораторных условиях конкретных культур.


Область применения: коллекционирование особо опасных вирусов.
Рекомендации по использованию: технология культивирования особо опасных вирусов.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования по указанной тематике.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2022 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта