Известно, что внутри- и межклеточное накопление нерастворимых белковых агрегатов, преимущественно в нейронах и сосудах головного мозга, четко коррели­рует с развитием таких тяжелых и до сих пор неизле­чимых синдромов, как болезнь Альцгеймера, Паркинсо­на, сенильная деменция, множественный склероз, боко­вой амиотрофический склероз, прионные болезни и др. (всего около 60 нозоформ). Белковая агрегация также яв­ляется причиной резкого снижения эффективности вы­хода биоактивных полипептидов при биотехнологиче­ском производстве, уменьшает срок годности и повы­шает токсигенность белок-содержащих лекарственных средств (гормоны, интерфероны, сыворотки, вакцины) и т. п. В этом плане преодоление феномена агрегации бел­ковых молекул in vivo является важной проблемой как для медицинской науки, так и биотехнологии.

В последнее десятилетие накапливаются доказа­тельства, что в основе процесса белковой агрегации ле­жат общие и простые принципы, по крайней мере это справедливо для белков с полностью или частично раз­вернутой полипептидной цепью, и склонность белка к агрегации четко определяется составляющей его по­следовательностью аминокислот. Более того, установ­лено, что только очень короткие аминокислотные от­резки полипептида, известные как «горячие точки» агрегации, определяют его агрегационные свойства. Их присутствие описано уже для большинства пептидов и белков, лежащих в основе нейродегенеративных болез­ней и системных амилоидозов.

Целью работы было идентифицировать наличие «горячих точек» агрегации у физиологически развер­нутых β-амилоидных пептидов (Аβ40 и Аβ42), являю­щихся критическими в патогенезе болезни Альцгейме­ра, и 12 нативно глобулярных прион-протеинов млеко­питающих и птиц (PrP человека, мыши, хомяка, кроли­ка, норки, овцы, оленя, лося, быка, кошачьих, экзотиче­ских антилоп и курицы), протеазоустойчивая изофор­ма которых считается коррелятом инфекционности при губкообразных энцефалопатиях, и сравнить получен­ные результаты с экспериментальными данными, до­ступными в литературе.

В работе использованы результаты экспериментов по аггрегационной способности каждой из 20 натив­ных аминокислот, ранее полученные репортерным ме­тодом in vivo (Santini S. et al, 2004). Аминокислотные последовательности исследуемых полипептидов были получены из электронной базы SwissProt database. Агрегационные профили белков рассчитывали путем присваивания соответствующих числовых значений каждому индивидуальному аминокислотному остатку (а.о.) в полипептидной цепи. Последовательность по­липептидов сканировали скользящей рамкой из 5, 7, 9 и 11 а.о с шагом через 1 а.о. Средние значения агрега­ционной активности аминокислот в скользящей рамке приписывались центральной аминокислоте. Крайним N-и C-терминальным аминокислотам определяли зна­чения, рассчитанные для первых центральных амино­кислот в скользящей рамке. «Горячие точки» агрегации были идентифицированы с помощью web-программы AGGRESCAN (http://bioinf.uab.es/aggrescan/) как обла­сти, содержащие не менее 5 а.о. в длину (минимальный размер, установленный до настоящего времени, кото­рый необходим для пептида, чтобы сформировать ами­лоидную фибриллу аналогичную таковой образован­ной полным полипептидом (Haspel N. et al., 2005)), у ко­торых агрегационные свойства являются выше средней агрегационной способности всей аминокислотной по­следовательности. Среднюю способность белка к агре­гации или пороговое значение «горячей точки» агрега­ции вычисляли как сумму агрегационных свойств ин­дивидуальных аминокислот, деленную на общее коли­чество аминокислотных остатков в цепи.

Полученные результаты были оценены в сравнении с доступными для анализа экспериментальными дан­ными относительно областей, известных как промо­тирующие агрегацию и фибриллизацию, фрагментов, агрегирующих in vivo (чаще после протеолиза) и син­тетических коротких (усеченных) пептидов, для кото­рых показана агрегация in vitro.

Установлено, что гидрофобные аминокислоты изо­лейцин, фенилаланин, валин и лейцин имеют наивыс­шую тенденцию вызывать агрегацию, тогда как поляр­ные (аспарагин, аргинин, гистидин), аспарагиновая и глутаминовая кислоты промотируют их раствори­мость, что в целом согласуется с общими представле­ниями, что гидрофобные взаимодействия играют опре­деляющую роль в белковой агрегации. Пролин лимити­рует активность «горячей точки».

Две основных области с высокой агрегационной ак­тивностью выделены в агрегационном профиле у поли­пептидов Аβ40 и Аβ42 - 16-21 и 30-40(42) а.о. При­чем вторая область у Аβ42 является, по-видимому, ре­зультатом вклада двух участков последовательности, включающих аминокислотные остатки 30-36 и 38-42, что превосходно согласуется с экспериментальными данными литературы.

В агрегационных профилях полноразмерных прион-протеинов (PrPC) у разных видов млекопитающих выявле­но от 5 до 7 «горячих точек». Первая из них расположена в неструктурированной N-терминальной части белка (≈1-22 а.о), но отсутствует в протеазоустойчивом коре «инфекци­онных» прион-протеинов (PrPd), что исключает ее участие в трансмиссии прионов и в процессе агрегации.

Четыре других C-терминальных «горячих точки» (у человека они представлены а.о. 178-186, 209-214, 229-237, 240-253) включают почти всю последователь­ность ?-спирали C-конца глобулярного домена, обо­значенную как спираль C. Интересно, что некоторые мутации, связанные с болезнью Крейтцфельдта-Якоба у человека, находятся в этой области прионного белка, и что они связаны с конверсией PrPC в PrPd, обладаю­щего нейротоксичностью. Также важно отметить, что основные структурные различия между прионными белками у различных видов были найдены тоже на кон­це С-спирали.

Центральная область PrPC, связывающая неструк­турированную N-концевую часть с глобулярным C-терминальным доменом, содержит 1 «горячую точ­ку» (у человека 2 в пределах а.о. 117-135, 137-142) и, как полагают, играет основную роль в конформацион­ных изменениях PrPC. В исследованиях с использова­нием синтетических пептидов PrP установлено, что не­прерывный сегмент прионного белка, охватывающий аминокислотные остатки 106-147, совпадающий со второй «горячей точкой» прион-протеинов, идентифи­цированной в нашем исследовании, является важным для проявления фибриногенных свойств белка. Один из синтетических пептидов, PrP106-126, который ло­кализован в пределах центральной области PrP и око­ло N-конца протеазоустойчивого кора PrPd, разделя­ет многие свойства с «инфекционной» формой прио­на, поскольку, как показано, легко формирует амилоид­ные фибриллы с высоким содержание β-структур, про­являет частичную устойчивость к обработке протеаи­назой K и обладает нейротоксичностью in vivo. Другой пептид (PrP118-135) вызывал, как установлено, гибель нейронов через индукцию апоптоза. Оба эти пептида картированы нами в центральной склонной к агрега­ции области прион-протеинов млекопитающих (у ку­рицы «горячая точка» агрегации в центральной обла­сти белка представлена а.о. 129-150).

Количество выявляемых «горячих точек» агрегации у исследуемых белков в целом не зависело от длины используемой скользящей рамки. Однако применение длинных рамок к относительно коротким последова­тельностям Аβ40 и Аβ42 приводит к чрезмерному сгла­живанию агрегационного профиля, при этом на графике различные «горячие точки» группируются вместе и тем самым маскируются и не могут быть разграничены при анализе. Применение коротких рамок к длинным после­довательностям (от 253 а.о. у человека до 264 а.о. у быка и 273 а.о. у курицы) вызывает появление ряда коротких графически малозначимых «горячих точек», характери­зующихся низкими показателями агрегационной актив­ности. Это согласуется с тем, что для более длинных последовательностей белка необходимы более крупные «горячие точки», чтобы обеспечить их агрегационный потенциал, в то время как небольшие «горячие точки» яв­ляются достаточными для агрегации коротких пептидов.

На основании полученных результатов установле­но, что для последовательностей полипептидов, содер­жащих до 50 аминокислот, наилучшие результаты ска­нирования «горячих точек» агрегации достигаются при использовании скользящей рамки длиной 5 а.о., для белков длиной ≤300 аминокислот - 9 а.о.

Полученные результаты согласуются с гипотезой, что короткие аминокислотные отрезки белков («горя­чие точки») действуют как точки нуклеации для фор­мирования упорядоченных фибриллярных структур при патогенезе церебральных амилоидозов.