Цель - разработать и оптимизировать параметры мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для ускоренной индикации и типирования патогенных диареегенных Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Salmonella spp., Campylobacter spp. в клинических об­разцах (копроматериал) с целью диагностики острых кишечных инфекций.

В процессе работы проводилась оптимизация временного и температурного режима ПЦР, концен­трации компонентов (полимеразы, буфера, магния, соотношение и активность олигонуклеотидов), раз­работка внутреннего позитивного контроля ампли­фикации. Предметом исследования являлись родо- и видоспецифические гены, кодирующие факторы па­тогенности наиболее значимых возбудителей ОКИ бактериальной этиологии. В разработанный состав реакции входят два праймер-микса, содержащие ра­бочие смеси праймеров, реагент-микс, положитель­ные контроли ДНК. В качестве положительного кон­троля использовали сконструированные ДНК, содер­жащие специфические последовательности ДНК ис­следуемых объектов. Мультипраймерная ПЦР позво­ляет одновременно использовать 3 пары олигонукле­отидов для коамплификации ДНК-матриц. При под­боре оптимальных условий амплификации с целью исключения формирования димеров праймеров были подобраны два состава праймер-смеси. Композици­онный состав ПЦР-смеси № 1 включает праймеры для амплификации мишеней omp (сальмонелла, 204 п.о.), сampy (кампилобактер, 840 п.о.), yst (иерсиния, 145 п.о.) и внутреннего контрольного образца (1026 п.н.) и № 2 - для амплификации мишеней stx (энте­рогеморрагической E. coli, 518 п.о.), virF (энтероин­вазивной E. coli, 618 п.о.), и еае (энтеропатогенной E. coli, 917 п.о.) и внутреннего контрольного образ­ца (1026 п.о.). В качестве внутреннего контрольного образца используется последовательность гена до­машнего хозяйства бактерий. Оптимизирована уни­версальная программа амплификации на основании выбранных в процессе тестирования оптимальных параметров времени и температур. Установлено, что для отжига сконструированных праймеров и синте­за ПЦР-продуктов требуется режим 96°C - 5 мин, (95°C - 40 с, 57°C - 40 с, 72°C - 40 с) - 28 ци­клов, 72°C - 5 мин. Чувствительность мультипрай­мерной ПЦР была протестирована на образцах ДНК с разной концентрацией. ДНК экстрагировали из се­рийных разведений культур C. jejuni, S. enteritidis, Y. enterocolitica, E. coli. Специфичность мультипрай­мерной ПЦР была проверена при тестировании ДНК бактерий близкродственных видов представителей нормальной микрофлоры и других возбудителей ки­шечных инфекций. Ложноположительные результа­ты не были зарегистрированы.

Метод обладает рядом преимуществ и расширя­ет возможности диагностики по сравнению с класси­ческими методами и обычной ПЦР, т. к. позволяет по­лучать результаты в течение нескольких часов, исполь­зуя клинический материал без предварительного этапа культивирования.

Разработанная мультиплексная ПЦР для диагно­стики ОКИ бактериальной этиологии позволяет в те­чение суток протестировать клинический материал на присутствие ДНК 6 наиболее актуальных возбудителей ОКИ, сделать заключение об этиологическом факторе, вызвавшем заболевание.

Разработана тест-система на основе мультиплекс­ной ПЦР, позволяющая идентифицировать и диффе­ренцировать между собой энтероинвазивные, энтеро­геморагические, энтеропатогенные E. coli, нетифоид­ные Salmonella spp., Y. enterocolitica, Campylobacter spp. методом мультиплексной ПЦР с детекцией мето­дом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Для повышения этиологической расшифровки и улуч­шения качества диагностики и терапии ОКИ может быть рекомендовано использование в диагностических лабораториях.