В настоящее время активно разрабатываются техно­логии и подбираются условия культивирования и нако­пления биомассы различных типов стволовых клеток для применения в терапевтических и исследователь­ских целях. Одной из проблем, которая стоит перед ис­следователями, является сложность выделения из тка­ни донора достаточного количества стволовых клеток и их экспансии в условиях культуры. Используют раз­личные подходы к увеличению пролиферативного по­тенциала культивируемых стволовых клеток и к селек­тивному выделению различных клеточных субпопуля­ций: внесение факторов роста, цитокинов, специфиче­ских ингибиторов отдельных метаболических путей, подбор условий микроокружения, 3D-культивирование и др. Наибольшее внимание уделяют способам экспан­сии гематопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, также проводится поиск аль­тернативных источников для получения in vitro био­массы мультипотентных стволовых клеток. Так, од­ним из альтернативных источников получения ство­ловых клеток является обонятельный эпителий чело­века. Благодаря сочетанию свойств мезенхимальных и нейральных стволовых клеток и относительной до­ступности, стволовые и прогениторные клетки обоня­тельного эпителия (СПК ОЭ) человека рассматривают как перспективный материал для применения в кле­точной терапии.

Цель - разработка метода экспансии СПК ОЭ для накопления клеточной биомассы.

Разработанный метод предполагает чередование этапов культивирования СПК ОЭ в ростовой среде, со­держащей эмбриональную сыворотку крупного рогато­го скота (FBS), с последующей заменой на бессыворо­точную ростовую среду, используемую для культивирования нейральных стволовых клеток, которая содер­жит эпидермальный (EGF) и фибробластный факторы роста (bFGF), инсулин-трансферрин-селеновую добав­ку (ИТС). На этапе получения первичной культуры ис­пользуется ростовая среда с содержанием 10-30% FBS. При пассировании гетерогенной по составу первичной культуры ОЭ начиная с 1-го пассажа действуют соглас­но следующей схеме:

1. Пересев культуры на ростовую среду с FBS.

2. На следующие сутки замена на ростовую среду с ИТС+ EGF + bFGF.

3. Культивирование клеток 4-7-х сут до индукции сферообразования и отделения конгламератов клеток от монослоя.

4. Сбор накопленных сфер, их трипсинизация для дезагрегазии клеток.

5. Пересев клеток субкультуры на ростовую среду с FBS.

6. Повторение пунктов 1-5 до 3-го пассажа (и далее, если есть необходимость).

Данный метод позволяет на этапе использования FBS обеспечивать хорошую адгезию популяции СПК ОЭ к поверхности культуральных флаконов, а на этапе роста в присутствии добавки ИТС + EGF + bFGF про­водить селекцию по пролиферативной активности пула СПК, которые растут в суспензии в виде сфер. При фенотипировании СПК ОЭ 3-го пассажа, накоплен­ных в соответствии с данным методом, установлено, что экспрессия нестина - маркера нейральных ство­ловых клеток, была выше на 30-40% по сравнению с клетками культур, субпассирование которых проводи­ли с использованием среды с добавлением только FBS. Индекс пролиферации СПК ОЭ, экспансию которых, проводили согласно предложенному методу, составил 4,5-5,5, в то время как в стандартный условиях - не выше 2,3-3,0.

Таким образом, предложенный метод экспансии позволяет накапливать биомассу СПК ОЭ человека в условиях культуры, поддерживать их высокую проли­феративную активность и недифференцированное со­стояние. Полученные данные позволяют разработать методы клеточной терапии различных заболеваний с использованием СПК ОЭ, расширить применение СПК ОЭ человека в фундаментальных исследованиях.