Использование мезенхимальных стволовых и про­гениторных клеток, в т. ч. клеток обонятельного эпите­лия (СПК ОЭ) человека, является перспективным на­правлением клеточной терапии.

В процессе длительного культивирования с целью достаточного накопления биомассы возникает риск ак­кумуляции генетических и эпигенетических аномалий в клетках, что может приводить к их спонтанной зло­качественной трансформации. Показано, что наличие гипо- или гиперметилированных участков (абберант­ное метилирование) в регуляторных областях некото­рых генов коррелирует с развитием онкологических за­болеваний. В связи с этим, имеется необходимость кон­тролировать биобезопасность клеток, подготовленных для трансплантации, на предмет потенциального риска малигнизации, связанного с эпигенетическим измене­нием паттерна метилирования.

В настоящее время для выявления метилирован­ных сайтов ДНК применяется довольно трудоемкий ме­тод бисульфитной конверсии. В то же время возможен альтернативный подход к решению проблемы - Bls I и Gla I ПЦР-анализ, который хорошо зарекомендовал себя при эпигенетическом типирования малигнантных кле­точных линий. Метод заключается в обработке ДНК ме­тилзависимыми эндонуклеазами GlaI или BlsI и после­дующей ПЦР с праймеров, окаймляющих исследуемый фрагмент ДНК. (Гончар Д.А., 2010; Акишев А.Г., 2011).

Цель - оптимизация метода определения риска злокачественной трансформации стволовых клеток че­ловека путем выявления сайтов дополнительного мети­лирования в промоторе гена-онкосупрессора DAPК1 с использованием Bls I и Gla I ПЦР-анализа.

Показано, что абберантное метилирование промо­тора онкосупрессора DAPK1 (ген протеинзиназы 1, во­влеченной в механизмы апоптоза и аутофагии) являет­ся фактором риска развития онкологических заболева­ний и часто выявляется у людей, страдающих хрониче­скими лейкозами, раком молочной железы, легких и др.

В качестве объекта исследования использовали культуры СПК ОЭ, полученные от 2-х доноров различ­ных пассажных уровней (3-8 пассажи), в т. ч. культу­ры, восстановленные после длительной криоконсер­вации. Также проведена оценка характера метилиро­вания промоторной области гена DAPK1 клеток куль­тур, в среду культивирования которых на протяжении нескольких пассажей вносили факторы роста (эпи­дермальный фактор роста и фактор роста фибробла­стов-2). Данные факторы используются для повыше­ния пролиферативной активности клеток, а также для поддержания культивируемых клеток в недифферен­цированном состоянии. Однако, факторы роста могут оказывать негативные эффекты, связанные с возмож­ностью изменения активности различных генов и запу­ска механизмов онкотрансформации клеток. Таким об­разом, важной задачей является контроль потенциаль­ного риска злокачественной трансформации СПК ОЭ, экспансия которых проходила как в стандартных усло­виях, так и в результате воздействия на клетки росто­вых факторов, а также культур, подвергнувшихся дли­тельному криохранению.

В результате Bls I и Gla I ПЦР-анализа метилиро­вания промотора гена-онкосупрессора DAPK1 куль­тур СПК ОЭ человека установлено, что со всех иссле­дуемых образцах образовывался ПЦР-продукт (отри­цательный результат рестрикции). Это свидетельству­ет о том, что в изучаемом CpG-участке отсутствова­ли сайты узнавания для метил-зависимых рестриктаз Bls I и Gla I, т. е. отсутствовали сайты дополнительно­го метилирования. В случае обработки клеточной ДНК рестриктазой, сайт узнавания которой присутству­ет в ограниченной праймерами области (рестриктаза HaeIII), после проведения ПЦР искомый ампликон не детектировался на электрофореграмме (положитель­ный контроль рестрикции). В образцах ДНК, не об­работанных рестриктазами, в процессе ПЦР накапли­вался ПЦР-продукт (отрицательный контроль рестрик­ции). Показано, что в отрицательном контроле интен­сивность свечения полосы с продуктом амплификации такая же, как и в случае Bls I и Gla I ПЦР-анализа.

Таким образом, установлено, что в процессе куль­тивирования и накопления биомассы культур СПК ОЭ человека в ранее оптимизированных условиях не отме­чается повышение риска злокачественной трансформа­ции клеток, связанного с эпигенетическим сверхмети­лированием промотора DAPK1. Не выявлено влияния условий культивирования на индукцию эпигенетиче­ского сверметилирования онкосупрессора DAPK1 при оценке культур разных пассажных уровней, восстанов­ленных после криоконсервации, а также культур, нако­пленных в присутствии ростовых факторов.

Данный метод может быть использован для выяв­ления риска злокачественной трансформации культур стволовых клеток.