Важной составляющей лечения острых нелимфо­бластных лейкозов (ОНЛЛ) является своевременный прогноз заболевания и оценка на каждом из этапов ле­чения эффективности терапии.

В настоящее время особое внимание уделяется по­иску молекулярно-генетических маркеров при ОНЛЛ. По данным различных исследований, ОНЛЛ часто сопровождается соматическими мутациями ряда ге­нов. К их числу относятся ген FLT3, мутации которого (FLT3-ITD и FLT3 D835), по данным литературы, опре­деляют неблагоприятный прогноз, ген NPM1 (благо­приятный прогноз, кроме случаев сочетания с мутаци­ями FLT3), ген CEBPA (благоприятный прогноз) и ген p53 (неблагоприятный прогноз).

Цель - анализ вклада мутаций генов FLT3, NPM1, CEBPA и p53 в формирование оценки прогноза заболе­вания у пациентов с ОНЛЛ и миелодиспластическим синдромом МДС (вариант - рефрактерная анемия с избытком бластов, РАИБ).

В целом в исследовании на добровольной основе приняли участие 120 пациентов, проходивших лече­ние в период 2009-2013 гг. в гематологическом отделе­нии для взрослых ГУ «РНПЦ РМиЭЧ». В зависимости от диагноза данные пациенты разделены на две груп­пы - МДС РАИБ и ОНЛЛ. Группа пациентов с МДС включала 23 человека - 14 мужчин и 9 женщин; сред­ний возраст 58 лет. Группа с ОНЛЛ сформирована из 97 пациентов, из них 38 мужчин и 59 женщин; средний возраст 54 года.

По классификации FAB группа исследования из числа пациентов с ОНЛЛ подразделялась на 5 под­групп (М0-М4).

Мутации FLT-ITD и NPM1 анализировали методом ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующи­ми 14-15 экзоны гена FLT3 и 11 интрон-12 экзон гена NPM1 с последующей электрофоретической детекци­ей в 2,7% агарозном геле с окраской бромистым эти­дием. Мутацию FLT3 D835 анализировали посред­ством метода RFLP-PCR с рестриктазой EcoRV. Мута­ции гена CEBPA выявляли методом SSCP-PCR в пре­делах всей кодирующей последовательности гена по­средством 12% неденатурирующего полиакриламид­ного гель-электрофореза с окраской серебром. Таким же методом анализировали мутации гена p53 в преде­лах 5-9 экзонов. Для идентификации мутаций генов CEBPA и р53 проводили секвенирование с прямым и обратным праймерами посредством генетического ана­лизатора AB3500.

В результате молекулярно-генетического анализа в группе пациентов с МДС РАИБ было выявлено два слу­чая соматических мутаций FLT3-ITD (8,7±5,9%), а так­же два случая мутации NPM1 (8,7±5,9%).

При ОНЛЛ было выявлено 50 случаев наличия в крови и/или костном мозге различных мутаций из чис­ла анализируемых: в 22 случаях (22,7±4,3%) - мута­ция FLT-ITD, в 21 (21,6±4,2%) - мутация гена NPM1, в клиническом материале 7 пациентов (7,2±2,6%) - му­тация D835 гена FLT3.

Наблюдались различия в составе и частоте встреча­емости анализируемых мутаций в различных подгруп­пах пациентов с ОНЛЛ (рис. 1).

Рис. 1. Распространенность мутаций генов FLT3-ITD и NPM1 в исследуемых группах и подгруппах пациентов с МДС РАИБ и ОНЛЛ

В ходе SSCP-анализа гена CEBPA в целом были вы­явлены 14 случаев подтвержденных секвенированием мутаций, которые встречались только в группе ОНЛЛ. У трех пациентов были выявлены по две мутации, ло­кализованные в различных анализируемых фрагмен­тах. В подавляющем большинстве наблюдений выяв­лены мутации в виде инсерций или делеций, включая относительно крупные - от 3 до 18 пар нуклеотидов. Также отмечены 4 случая однонуклеотидных замен. При этом в трех случаях мутация представляла собой синонимическую замену g.5512G>A, что предположи­тельно не может привести к клинически значимому эф­фекту. В одном случае присутствовала несинонимиче­ская замена g.6027G>C, приводящая к изменению ко­дирующей последовательности p.Arg306Pro.

Распределение выявленных мутаций по группам и подгруппам исследования было неравномерным (рис. 2). Расчеты произведены по числу пациентов с мутаци­ями (11 случаев) без учета двойных мутаций.

Рис. 2. Распределение мутаций гена CEBPA по группам и подгруппам исследования

В ходе анализа ДНК, выделенной из костного моз­га 120 пациентов, выявлены 17 случаев подтвержден­ных секвенированием соматических мутаций гена р53, локализованных в пределах 5-9 экзонов. При этом у трех пациентов были выявлены одновременно по две различные мутации. Распространенность мутаций гена р53 по подгруппам наглядно представлена на рис. 3.

Рис. 3. Распространенность мутаций генов р53 в исследуемых группах и подгруппах пациентов с МДС РАИБ и ОНЛЛ

Для того чтобы оценить, какой вклад могут внести исследуемые нами мутации в оценку прогноза и эффек­тивности лечения и насколько они дополнят традици­онный спектр цитогенетических маркеров, был прове­ден анализ сопряженности выявленных мутаций и хро­мосомных аберраций в исследуемых группах и под­группах пациентов с МДС РАИБ и ОНЛЛ.

В соответствии с протоколом диагностики ОНЛЛ в пределах исследуемой группы (МДС РАИБ+ОНЛЛ) был проведен молекулярно-генетический анализ хро­мосомных транслокаций t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q21) и inv(16)(p13;q22), а также цитогенетический анализ хромосомных аберраций. В результате только у 25 пациентов выявлена какая-либо хромосомная абер­рация, что составляет 20,8±3,7%.

При использовании в качестве маркеров только му­тации FLT3 и NPM1 охватывается группа из 39 пациен­тов (32,5±4,3%). Добавление в тестирование мутаций CEBPA и р53 без хромосомных аберраций увеличива­ет группу с прогностическими маркерами до 60 чело­век (50,0±0,6%).

Совместное использование при тестировании всех анализируемых мутаций и хромосомных аберраций по­зволяет охватить прогностическими маркерами группу из 72 пациентов, что составляет 60,0±0,7%. Таким об­разом, использование молекулярно-генетических марке­ров позволяет расширить общую группу с какими-либо прогностическими характеристиками почти на 40%.

В отдельной группе пациентов с ОНЛЛ количество выявленных хромосомных аберраций составило 21 из 97 обследованных (21,6±0,5%).

При совместном использовании всех анализируе­мых соматических мутаций группа с маркерами про­гноза и эффективности лечения включает 51 пациента из 97 (52,6±0,7%).

Совместное использование всех анализируемых маркеров, включая хромосомные аберрации, позволя­ет охватить прогностическими маркерами группу из 61 пациента с ОНЛЛ (62,9±0,8%). Иными словами, ис­пользование молекулярно-генетических маркеров со­вместно с цитогенетическими расширяет группу с прогностическими маркерами на 41,3% относительно только цитогенетических данных. Таким образом, те­стирование молекулярно-генетических маркеров суще­ственно улучшает оценку прогноза пациентов с ОНЛЛ и более эффективно контролирует процесс лечения.