В настоящее время высокодозная химиотерапия с последующей аутотрансплантацией гемопоэтиче­ских кроветворных клеток является одним из стан­дартных методов лечения онкогематологической па­тологией. При этом в ряде случаев возникают трудно­сти с заготовкой количества CD34⁺ клеток, достаточно­го для выполнения трансплантации. Решение пробле­мы -- наращивание гемопоэтических стволовых кле­ток и клеток-предшественников в условиях ex vivo. Од­ним из главных условий применения клеточных техно­логий в практической медицине является их безопас­ность для пациента. При разработке технологии куль­тивирования клеток необходимо исключить использо­вание добавок ксеногенного происхождения и обеспе­чить подбор условий не только стимулирующих про­лиферацию, но и предупреждающих высокую клеточ­ную гибель в культуре. Культивирование клеток in vitro может приводить к возникновению клеток с аберрант­ным кариотипом и их позитивной селекции в популя­ции. Для многих типов стволовых клеток взрослого человека показано накопление значительного количе­ства хромосомных перестроек после длительного ве­дения культуры. Уменьшение времени культивирова­ния способствует сохранению нормального кариотипа. Кроме изучения генетической стабильности необходим контроль наличия резидуальных клональных клеток в трансплантате, потенциально способных вызвать реци­див заболевания.

Цель -- разработать клинически безопасную тех­нологию ex vivo экспансии мобилизированных CD34⁺ клеток периферической крови для аутологичной транс­плантации пациентам с лимфопролиферативными за­болеваниями.

Разработана технология краткосрочной ex vivo экс­пансии кроветворных клеток в условиях сокультивиро­вания с аутологичными мезенхимальными стромаль­ными клетками костного мозга (МСК КМ) пациента, которая не приводит к образованию остаточных опухо­левых клонов и изменению кариотипа, а также способ­ствует сохранению высокой жизнеспособности кле­ток.

Краткосрочную экспансию гемопоэтических кле­ток и клеток-предшественников периферической кро­ви ex vivo проводили в условиях сокультивирования с аутологичными МСК пациента в бессывороточной сре­де без использования реагентов животного происхо­ждения. Разработанный метод позволяет увеличить ко­личество ядросодержащих клеток в 12±5,5 раз, коли­чество CD34+ -- в 6,7±3,3, колониеобразующих еди­ниц миелоидного ряда -- в 8,0±5,5 за 5 дней культиви­рования.

Для анализа жизнеспособности клеток методом проточной цитофлуориметрии определяли процент клеток, несущих маркеры ранней и поздней стадий апоптоза. Используемые условия и методология экс­пансии не приводили к некрозу или существенному увеличению количества апоптотических клеток. В слу­чае сохранения целостности монослоя на протяжении всего периода сокультивирования доля апоптотических и некротических гемопоэтических клеток не превыша­ла 1%.

Цитогенетический анализ показал, что во всех об­разцах (нативный лейкоконцентрат, клетки после CD34-сепарации, гемопоэтические клетки после экс­пансии) наблюдается нестабильность генома, выража­ющаяся в гипоплоидии клеток. После культивирова­ния клеток ex vivo грубых структурных изменений хро­мосом, а также одиночных и парных фрагментов не выявлено. Также не обнаружено статистически значи­мых различий в количестве клеток с аберрантным ка­риотипом до и после экспансии.

На наличие резидуальных клональных клеток про­анализированы кроветворные клетки пациентов с мно­жественной миеломой и неходжкинской лимфомой до и после экспансии (метод проточной цитофлуориме­трии с последующим постадийным гейтированием). Обнаружено присутствие клональных плазматических клеток (CD45-CD138+СD56+ фенотип) в образцах КМ пациентов с множественной миеломой, однако подоб­ные клетки не выявлены ни в лейкоконцентрате пери­ферической крови, ни в CD34+-селектированных гемо­поэтических клетках, подвергнутых экспансии.