Цель -- оценить связь полиморфизма гена MDR1 (C3435T) с лекарственной чувствительностью лим­фоцитов при хроническом лимфоцитарном лейкозе (ХЛЛ-лимфоциты).

MDR1 является одним из генов, отвечающих за мно­жественную лекарственную устойчивость. Он кодиру­ет интегральный белок P-gp, основная функция которо­го заключается в энергозависимом транспорте веществ через клеточную мембрану. Многие лекарственные средства являются субстратами P-gp, поэтому экспрес­сия гена MDR1 и активность его продукта может непо­средственно влиять на эффективность терапии лекар­ственными средствами. Вариация экспрессии MDR1 в нормальных тканях, по-видимому, регулирует биодо­ступность лекарственных средств. Известен факт кор­реляции in vivo между экспрессией и полиморфизмом гена MDR1 и активностью P-gp в кишечнике. Этот по­лиморфизм проявляется в замене цитозина (С) на ти­мин (T) в позиции 3435 (расположен в 26 экзоне гена MDR1). Хотя замена нуклеотида С на T не приводит к изменению структуры P-gp, T аллель ассоциирован со значительно меньшей экспрессией гена MDR1 по срав­нению с С аллелем. Предполагается, что полиморфизм гена MDR1 (C3435T) в ХЛЛ-лимфоцитах может быть связан с их ответом на воздействие различных лекар­ственных средств.

Новизна данного исследования заключается в том, что в Республике Беларусь впервые определена часто­та встречаемости генотипов C3435T полиморфизма гена MDR1 при ХЛЛ и в выявлении возможных разли­чий в лекарственной чувствительности образцов ХЛЛ-клеток в зависимости от полиморфизма этого гена.

В исследовании использовали 33 образца перифе­рической крови, полученные из Республиканского цен­тра гематологии и пересадки костного мозга (9-я го­родская клиническая больница г. Минска). Выделе­ние лимфоцитов из периферической крови проводи­ли согласно стандартной методике путем наслоения цельной крови на градиент фиколл-верографина. Вы­деленные лимфоциты культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma, США) с добавлением 10% фетальной те­лячьей сыворотки, 2 мM L-глутамина (Sigma, США), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂. Для опреде­ления спектра лекарственной чувствительности ХЛЛ-лимфоцитов их культивировали с препаратами, пред­ставленными в таблице, в концентрации, позволяющей выявить индивидуальную чувствительность образцов клеток.

Выживаемость лимфоцитов после контакта с ле­карственными средствами определяли с помощью МТТ-теста, основанного на способности живых кле­ток перерабатывать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид в формазан, количество которого можно измерить с помощью спектрофотоме­тра.

Геномную ДНК выделяли из ХЛЛ-лимфоцитов пе­риферической крови. Лизис мембраны клеток проводи­ли с помощью раствора White Cell Lysis Buffer (WCLB) с добавлением насыщенного раствора хлорида аммо­ния. Из раствора ДНК осаждали с помощью добавле­ния равного объёма изопропанола. Полученный осадок геномной ДНК отмывали в 70% этаноле, после центри­фугирования спирт удаляли из пробирки дозатором, а остатки этанола высушивали на воздухе. Осажденную ДНК растворяли в деионизированной воде. Конечная концентрация ДНК составляла 100 мкг/мл.

Полиморфизм гена MDR1 в положении C3435T определяли на базе Института генетики и цитологии НАН Беларуси в лаборатории моделирования генети­ческих процессов. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе MyCycler^TM Termal cycler (BIORAD). Для амплификации фрагмента гена MDR1 использовали прямой и обратный праймер, 1 x буфер, смесь Quick-Load Taq 2X Master Miх^TM(Праймтех). Для изучения полиморфизма C3435T амплифицированный фрагмент длиной 207 п.н. подвергали рестриктному расщеплению эндонуклеазой MboI. Продукты рестрик­ции фракционировали в 2,2%-м агарозном геле при на­пряжении 120В/см и визуализировали в транслюмина­торе при УФ-излучении. Генотипы идентифицировали по длине полученных в ходе рестрикции фрагментов.

Для математической обработки и статистическо­го анализа данных использовали программы MSEx­cel 2011 и GraphPad Prism версии 5,00 для Windows. Различия считались статистически достоверными при p<0,05.

Для сравнения использовали представленные Е.П. Михаленко данные о частоте встречаемости полимор­физма гена MDR1 у доноров крови Республики Бела­русь. Частота встречаемости вариантного генотипа TT гена MDR1 в ХЛЛ-клетках выше, чем в группе здоро­вых лиц. Однако статистически это не удалось подтвер­дить. При этом интересно отметить, что в независимом исследовании польской популяции частота встречае­мости вариантного генотипа TT гена MDR1 у пациен­тов с ХЛЛ выше, чем у доноров, как в нашем исследо­вании, однако в этом случае различия оказались стати­стически достоверными в связи с большим числом изу­ченных образцов ХЛЛ-лимфоцитов.

Все образцы клеток условно разделены в зависимо­сти от их ответа на действие лекарственных средств ex vivo на чувствительные и резистентные к конкретным препаратам (таблица).

Среди образцов ХЛЛ-лимфоцитов, резистентных к действию флударабела, иматиниба и бортезомиба, ге­нотип CC не обнаружен. Можно предположить, что ал­лель T способствует формированию устойчивости к действию этих препаратов в лимфоцитах при ХЛЛ ex vivo.

Цитостатики, используемые в исследовании, про­анализированы также с точки зрения принадлежно­сти их к субстратам P-gp. Оценивали также диапазон чувствительности ХЛЛ-клеток к различным по меха­низму действия лекарственным средствам в зависимо­сти от вариантного генотипа гена MDR1. Так, при ге­нотипе CC по сравнению с генотипами CT и TT на­блюдается тенденция к большей чувствительности ХЛЛ-лимфоцитов к препаратам ex vivo, которые яв­ляются субстратами P-gp (этопозид, иматиниб и бор­тезомиб), или не являются таковыми (флударабел, ци­тарабин). В случае с бортезомибом чувствительность ХЛЛ-лимфоцитов к нему при генотипе CC статистиче­ски отличалась от таковой лимфоцитов с генотипом TT (p=0,037).

Так как генотип MDR1 с аллелем T в положении C3435T отвечает за меньшую экспрессию P-gp, то со­ответственно, клетки, обладающие генотипами CT/TT, медленнее выводят ксенобиотики и их метаболиты из организма, индуцируя тем самым активирование дру­гих механизмов элиминации чужеродных веществ из клетки. Эта гипотеза может объяснить варианты мень­шей чувствительности к действию цитостатических препаратов в образцах клеток, содержащих аллель T.

Таким образом, частота встречаемости вариантных генотипов MDR1 в ХЛЛ-лимфоцитах статистически не отличается от контрольной частоты полиморфизма гена MDR1 в положении C3435T, установленной для этих клеток у жителей Беларуси. Вместе с тем, ХЛЛ-лимфоциты с вариантами полиморфизма TT и СС ха­рактеризуются различиями в чувствительности к бор­тезомибу. Резистентность образцов ХЛЛ-лимфоцитов к действию флударабела, иматиниба и бортезомиба не сочеталась с наличием генотипа CC. Так как чувстви­тельность ХЛЛ-лимфоцитов к отдельным лекарственным средствам обычно обусловлена многими факторами, то прогнозирование ответа на терапию с целью ее персо­нализации может быть затруднено без непосредствен­ного определения лекарственной чувствительности клеток ex vivo.