УДК: 616.71-091-089.843-018]:57.085
Год издания: 2014

Технология приготовления in vitro клеточного трансплантата для замещения костного дефекта у экспериментальных животных

Космачева С.М.Данилкович Н.Н.Деркачев В.С.Алексеев С.А.Потапнев М.П.
Рубрики: 76.29.3376.29.41
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий
Тема НИР: «Разработать трансплантат на основе стволовых клеток и биокомпозитных материалов для замещения дефектов трубчатых костей» в рамках задания 01.22 «Разработать метод пространственно-разделенного насыщения коллагенгидроксиапатитного матрикса аутологичными стволовыми клетками (клетками-предшественниками остеобластов) для замещения дефектов трубчатых костей».
Сроки выполнения НИР: апрель 2011 г. — декабрь 2014 г.
Научный руководитель: канд. мед. наук, доц. С.М. Космачева, д-р мед. наук, проф. С.А. Алексеев.
Соисполнители: УО «Белорусский государственный медицинский университет».
Источник финансирования: госбюджет.

По современным представлениям, для конструи­рования костных трансплантатов и их эффективного приживления необходимы три компонента: остеоген­ные клетки, материал-носитель, микроокружение. В настоящее время разработан ряд материалов на осно­ве фосфатов кальция с разным соотношением Ca/P, структурой кристаллической решетки и материалы на основе гидроксиапатита (ГА) с катионными и анион­ными изоморфными замещениями, существенно вли­яющими на свойства керамики. Материалы на основе ГА исследованы на биосовместимость при подкожной имплантации животным и эффективность при замеще­нии костных дефектов у животных. Испытания in vivo материалов на основе ГА показали, что эти материалы не вызывали реакции отторжения, активно участвова­ли в образовании новой костной ткани при замещении дефектов. Однако только искусственный материал не способен участвовать в восстановлении кости, поэтому в последнее время предполагают использовать искус­ственные материалы в совокупности с аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками (МСК). Боль­шой интерес к стромальным клеткам костного моз­га (КМ) обусловлен тем, что эти клетки довольно лег­ко можно выделить из небольших аспиратов КМ паци­ента, а после многократного наращивания их количе­ства и манипуляций in vitro трансплантировать ему же без риска отторжения и необходимости иммуносупрес­сии. В настоящее время в клинической практике с це­лью остеогенеза находит применение метод использо­вания обогащенной тромбоцитами аутоплазмы или ли­затов тромбоцитов. В тромбоцитах содержатся много­численные факторы роста и цитокины, способствую­щие свертыванию крови, регенерации ткани и процес­сам минерализации кости.

Цель -- разработка состава биокомпозитного транс­плантата для замещения дефекта костной ткани.

Сущность достижения -- разработка технологии получения трансплантата на основе релизата тромбо­цитов, мезенхимальных стволовых клеток, остеопла­стических материалов, фибринового геля и доказатель­ство эффективности разработанного биотрансплантата на экспериментальной модели животных.

МСК получали из костного мозга человека и куль­тивировали in vitro. Остеогенную дифференцировку МСК осуществляли после двух пассажей путем до­бавления 10 мМ β-глицерофосфата, 50 мкг аскорбино­вой кислоты и 0,1 мкМ дексаметазона. Клетки культи­вировали в течение 3-5 дней до трансплантации кро­ликам с краевым дефектом лучевой кости передних лап. Релизаты тромбоцитов (РТ) получали путем ак­тивации тромбином in vitro отмытых тромбоцитов че­ловека. Частичный краевой дефект лучевой кости на 1/2-1/3 диаметра кости длиной 15-20 мм со вскры­тием костно-мозгового канала и удалением костно­го мозга заполняли биотрансплантатом, содержащим РТ, остеогенно-дифференцированные МСК (около 1 млн клеток), остеопластическим материалом Колла­пан (пр-во ООО «Интермедапатит», РФ), Кафам (пр-во ИОНХ НАН РБ), Остеоматрикс (пр-во «ООО «Коннек­тбиофарм», РФ), Гиалуост (пр-во ООО «Омега Дент», РФ). Сверху биотрансплантат фиксировали препара­том фибринового геля «Фибриностат» (пр-во РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий, РБ). Заживление дефекта кости оценивали по результатам компьютерно-томографического (КТ) и гистологиче­ского (с окраской гематоксилин-эозином) исследова­ния через 1 и 2 мес.

Показано, что культивирование МСК в присут­ствии 2,5-10,0% РТ приводит к увеличению скоро­сти деления клеток. Так, в присутствии 2,5% РТ вре­мя удвоения МСК составило 9,75±1,52 ч, а в контро­ле без РТ - 22,58±3,44 ч. Это позволило быстро и эф­фективно нарастить клеточную массу МСК. Добавле­ние 2,5% РТ при остеогенной дифференцировке так­же потенцировало эффект индукторов остеогенеза в культуральной среде. Окраска на щелочную фосфата­зу, особенно ализариновым красным на 21-й день куль­тивирования была значительно более интенсивной под действием РТ. Уровень мРНК гена остеопонтина в остеогенно-дифференцированных МСК в эти сро­ки возрастал дозозависимо при добавлении в культу­ру клеток 1-5% РТ. В более ранние сроки (14 дней) РТ вызывал у остеогенно-индуцированных МСК повыше­ние в 3,3-12,3 раза уровня мРНК гена щелочной фос­фатазы. Таким образом, исследования in vitro позволи­ли показать положительное влияние РТ на пролифера­цию и дифференцировку МСК для использования в ка­честве клеточного составляющего остеогенного био­трансплантата.

Для замещения костных дефектов лучевой кости передних лап кроликов нами предложена композиция биотрансплантата, включающая РТ, остеогенный мак­трикс, остеогенно дифференцированные in vitro в тече­ние 3-5 дней МСК (около 1 млн клеток), фиксирован­ные снаружи фибриновым гелем. Полученная компо­зиция наносилась на очищенный дефект кости под тио­пенталовым наркозом. Ближайшее наблюдение за кро­ликами не выявило признаков общего или локально­го воспаления. Проведенный через 1 мес. анализ дан­ных денситометрии остеогенного восстановления в ме­сте костного дефекта выявил снижение плотности ко­сти при применении остеоматрикса и повышение плот­ности кости при использовании кафама по сравнению с контролем (р=0,0012 и р=0,0042 соответственно). Плот­ность кости при применении пластин коллапана была выше, чем гранул (р=0,031). При назначении остеома­трикса через 2 мес. учета выявлено повышение плот­ности кости по сравнению с контролем (р=0,0395). КТ через 1 и 2 мес. учета не позволила определить, какой тип остеогенного матрикса в составе биотранспланта­та имеет преимущества по восстановлению остеогене­за. Морфологические исследования препаратов костей животных позволили выявить более ускоренное (по сравнению с контролем) восстановление костной тка­ни при использовании пластин коллапана.

Таким образом, композиция биотрансплантата в со­ставе релизата тромбоцитов, предифференцированных в остеогенном направлении МСК, остеопластических материалов (лучше - пластины коллапана), фибриново­го геля эффективна для замещения костного дефекта в экспериментальной модели животных.


Область применения: травматология, хирургия, клеточные биотехнологии.
Рекомендации по использованию: рекомендуется использовать для замещения больших дефектов трубчатых костей, при длительном несращении переломов, при образовании ложных суставов.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования для изучения свойств материалов-носителей для мезенхимальных стволовых клеток, разработки новых составляющих трансплантатов.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2018 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта