В последнее десятилетие ведутся работы по поис­ку и характеристике новых источников ГСК для реге­неративной медицины. Показано, что ткань плаценты содержит дополнительный пул ранних предшественни­ков кроветворения. Выделение и экспансия этих клеток ex vivo позволили бы значительно снизить риск транс­плантаций пуповинной крови за счет сокращения пе­риода длительной посттрансплантационной цитопе­нии, обусловленной низким содержанием кроветвор­ных клеток. В связи с вышеизложенным представля­ет интерес изучение возможности наращивания CD34⁺ клеток плаценты, полученных после забора основного объема пуповинной крови.

Цель -- обосновать возможность экспансии гемопо­этических клеток плаценты.

Образцы плаценты и пуповинной крови были пре­доставлены ГУ «РНПЦ "Мать и дитя"» Минздрава Ре­спублики Беларусь после получения согласия рожениц.

После основного забора пуповинной крови плацен­ту доставляли в лабораторию в контейнере со льдом в течение 60 мин после родов. Из плаценты вырезали ко­тиледон 30-50 г и механически измельчали на фрагмен­ты от 0,5 до 1,5 см в диаметре. Гомогенизацию прово­дили при 4°С путем мягкого перетирания ткани в сте­клянном гомогенизаторе с последующей фильтрацией через нейлоновые фильтры, имеющие размер пор 60 мкм.

Получение мононуклеарной фракции проводили путем разделения клеточной суспензии на градиенте плотности фиколла (1,077 г/л). Обогащенную CD34+ клетками фракцию мононуклеаров получали с помо­щью иммуномагнитной сепарации набором EasySep (StemСell Technologies, Канада) согласно инструкции производителя.

Обогащенные иммуномагнитной сепарацией CD34-положительные клетки плаценты и пуповинной кро­ви подвергали параллельному сокультивированию с мезенхимальными стромальными клетками костного мозга здорового донора (МСК КМ) в бессывороточной среде с добавлением фактора стволовых клеток, лиганд тирозинкиназы-3 эмбриональной печени и тромбопо­этина.

После 8-дневной экспансии количество CD34-положительных клеток пуповинной крови и плаценты увеличилось в 30 и 5 раз соответственно.

Иммунофенотипический анализ показал, что исход­но большинство выделенных CD34-положительных клеток плацентарного происхождения не экспрессиру­ют маркеры миелоидного ряда CD45 и CD33 в отли­чие от аналогичной популяции CD34-положительных клеток пуповинной крови. Однако после экспансии все кроветворные предшественники плацентарного про­исхождения имели панлейкоцитарный маркер CD45 и кластер ранней миелоидной дифференцировки CD33.

Функциональные свойства кроветворных предше­ственников миелоидного ряда подтверждали колоние­образующим тестом в полужидкой среде. При анализе субпопуляционного состава колониеобразующих еди­ниц плаценты до и после сокультивирования с МСК КМ наблюдали все типы коммитированных и смешан­ных колоний эритроидного, гранулоцитарного и моно­цитарного ростка кроветворения. По всем колониео­бразующим единицам после сокультивирования отме­чен прирост в 1125 раз для клеток плацентарного про­исхождения и в 65 -- для пуповинной крови одного и того же образца.

Следует отметить, что в культуре клеток плаценты на момент завершения экспансии одна из двух CD34⁺ клеток была колониеобразующей (исходно - одна из 450), тогда как в культуре клеток пуповинной крови - одна из 6 (исходно - одна из 13). Полученные резуль­таты указывают на то, что среди исходной популяции выделенных CD34-положительных клеток плаценты лишь очень малая их часть относится к стволовым кро­ветворным клеткам или предшественникам миелоид­ного ряда.

Таким образом, показана возможность значитель­ной (более чем в 1000 раз) экспансии кроветворных предшественников миелоидного ряда, полученных из плаценты после забора основного объема пуповинной крови. Эффективность и экономическая целесообраз­ность выделения и экспансии CD34-положительных клеток из плаценты требует дальнейшего изучения.