УДК: 616.15-018:618.36/.38]:005.591.3
Год издания: 2014

Экспансия гемопоэтических предшественников, полученных из плаценты человека после забора основного объёма пуповинной крови

Фурман О.Г.Костюнина В.С.Васина Е.В.Петевка Н.В.Хулуп Г.Я.Потапнев М.П.
Рубрики: 62.33.31
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий
Тема НИР: «Разработать технологию получения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) плаценты человека для увеличения клеточности трансплантата пуповинной крови. Изучить возможности направленной дифференцировки и экспансии ex vivo стволовых клеток плацентарного происхождения».
Сроки выполнения НИР: апрель 2011 г. – декабрь 2013 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. М.П. Потапнев, д-р мед. наук, проф. Г.Я. Хулуп.
Источник финансирования: госбюджет.

В последнее десятилетие ведутся работы по поис­ку и характеристике новых источников ГСК для реге­неративной медицины. Показано, что ткань плаценты содержит дополнительный пул ранних предшественни­ков кроветворения. Выделение и экспансия этих клеток ex vivo позволили бы значительно снизить риск транс­плантаций пуповинной крови за счет сокращения пе­риода длительной посттрансплантационной цитопе­нии, обусловленной низким содержанием кроветвор­ных клеток. В связи с вышеизложенным представля­ет интерес изучение возможности наращивания CD34+ клеток плаценты, полученных после забора основного объема пуповинной крови.

Цель -- обосновать возможность экспансии гемопо­этических клеток плаценты.

Образцы плаценты и пуповинной крови были пре­доставлены ГУ «РНПЦ "Мать и дитя"» Минздрава Ре­спублики Беларусь после получения согласия рожениц.

После основного забора пуповинной крови плацен­ту доставляли в лабораторию в контейнере со льдом в течение 60 мин после родов. Из плаценты вырезали ко­тиледон 30-50 г и механически измельчали на фрагмен­ты от 0,5 до 1,5 см в диаметре. Гомогенизацию прово­дили при 4°С путем мягкого перетирания ткани в сте­клянном гомогенизаторе с последующей фильтрацией через нейлоновые фильтры, имеющие размер пор 60 мкм.

Получение мононуклеарной фракции проводили путем разделения клеточной суспензии на градиенте плотности фиколла (1,077 г/л). Обогащенную CD34+ клетками фракцию мононуклеаров получали с помо­щью иммуномагнитной сепарации набором EasySep (StemСell Technologies, Канада) согласно инструкции производителя.

Обогащенные иммуномагнитной сепарацией CD34-положительные клетки плаценты и пуповинной кро­ви подвергали параллельному сокультивированию с мезенхимальными стромальными клетками костного мозга здорового донора (МСК КМ) в бессывороточной среде с добавлением фактора стволовых клеток, лиганд тирозинкиназы-3 эмбриональной печени и тромбопо­этина.

После 8-дневной экспансии количество CD34-положительных клеток пуповинной крови и плаценты увеличилось в 30 и 5 раз соответственно.

Иммунофенотипический анализ показал, что исход­но большинство выделенных CD34-положительных клеток плацентарного происхождения не экспрессиру­ют маркеры миелоидного ряда CD45 и CD33 в отли­чие от аналогичной популяции CD34-положительных клеток пуповинной крови. Однако после экспансии все кроветворные предшественники плацентарного про­исхождения имели панлейкоцитарный маркер CD45 и кластер ранней миелоидной дифференцировки CD33.

Функциональные свойства кроветворных предше­ственников миелоидного ряда подтверждали колоние­образующим тестом в полужидкой среде. При анализе субпопуляционного состава колониеобразующих еди­ниц плаценты до и после сокультивирования с МСК КМ наблюдали все типы коммитированных и смешан­ных колоний эритроидного, гранулоцитарного и моно­цитарного ростка кроветворения. По всем колониео­бразующим единицам после сокультивирования отме­чен прирост в 1125 раз для клеток плацентарного про­исхождения и в 65 -- для пуповинной крови одного и того же образца.

Следует отметить, что в культуре клеток плаценты на момент завершения экспансии одна из двух CD34+ клеток была колониеобразующей (исходно - одна из 450), тогда как в культуре клеток пуповинной крови - одна из 6 (исходно - одна из 13). Полученные резуль­таты указывают на то, что среди исходной популяции выделенных CD34-положительных клеток плаценты лишь очень малая их часть относится к стволовым кро­ветворным клеткам или предшественникам миелоид­ного ряда.

Таким образом, показана возможность значитель­ной (более чем в 1000 раз) экспансии кроветворных предшественников миелоидного ряда, полученных из плаценты после забора основного объема пуповинной крови. Эффективность и экономическая целесообраз­ность выделения и экспансии CD34-положительных клеток из плаценты требует дальнейшего изучения.


Область применения: клеточная биология, трансплантология, регенертивная медицина.
Рекомендации по использованию: в учреждениях онкологического профиля при трансплантациях пуповинной крови.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования, совместная апробация разработанных технологий в трансплантологии и банкировании стволовых клеток пуповинно-плацентарного происхождения.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2022 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта