Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) челове­ка сохраняют способность к пролиферации и диффе­ренцировке при культивировании in vitro, а также при реимплантации, что обусловливает их высокую значи­мость в клинической практике, в т. ч. и для лечения сим­птоматической эпилепсии. Ряд исследователей, указа­ли на возможность получения из МСК нейрональных предшественников с последующей дифференцировкой в различные типы нервной ткани (нейроны, астроциты, олигодендроциты). При нейрогенной дифференцировке МСК, как правило, используются комбинации химиче­ских агентов либо специфических нейрогенных сред и ростовых факторов, вызывающие запуск экспрессии ге­нов, характерных для стволовых клеток нервной ткани.

Цель -- изучить характер экспрессии нестина - мар­кера нервной ткани - при нейроиндукции МСК костно­го мозга (КМ) пациентов с эпилепсией.

Показано изменение экспрессии нестина в МСК КМ пациентов с эпилепсией после нейрогенной индукции in vitro. Установлено, что экспрессия нестина в нейро­индуцированных и интактных МСК носит перманент­ный характер.

МСК КМ пациентов с эпилепсией получали по стан­дартной методике и поддерживали в культуре в среде αMEM с добавлением 5% сыворотки крови человека группы АВ (IV). При достижении культурой клеточно­сти, достаточной для инфузии (0,5-1 млн клеток на 1 кг массы пациента), клетки переводили на нейроиндукци­онную среду (NeuroCult с добавлением EGF и FGF-2) на период 7 сут. Часть контрольных клеток, культиви­руемых в среде αMEM без добавления дифференциро­вочных факторов, и нейроиндуцированных МСК от­бирали для выделения РНК и анализа методом проточ­ной цитометрии. РНК подвергали обратной транскрип­ции и количественной ПЦР. Результаты анализирова­ли с использованием парного теста Уилкоксона в про­граммном обеспечении Graphpad Prism 5.03. Часть кле­ток подвергали внутриклеточному окрашиванию анти­телом к нестину, меченным AlexaFluor 488.

Нестин представляет собой белок промежуточ­ных филаментов типа VI, характерный, главным обра­зом, для клеток-предшественников субвентрикулярной зоны. Нестин экспрессируется в незрелых делящихся клетках нервной ткани, увеличение экспрессии данно­го маркера свидетельствует о достаточной степени не­завершенности процесса нейрогенной индукции. Не­стин считается маркером высокой пролиферативной активности, также его прочно ассоциируют с тканями, в которых происходит активный ангиогенез.

Интактные и нейроиндуцированные МСК костного мозга трех пациентов с эпилепсией анализировали на предмет экспрессии нестина на уровне как мРНК, так и белка.

Анализ методом количественной ПЦР выявил ста­тистически значимое увеличение экспрессии нестина в МСК после нейроиндукции в 35,84 раза (диапазон 30,683-41,756, р = 0,0048) (рис. 1А).

Методом проточной цитометрии установлено, что процент нестин-положительных клеток составил 85,88 ± 8,05% среди неиндуцированных МСК и 77,76 ± 4,71% среди нейроиндуцированных МСК (р > 0,5) (рис. 1Б-1В).

Рис. 1. - Экспрессия нестина в нейроиндуцированных мезенхимальных стволовых клетках костного мозга пациентов с эпилепсией

А - результаты количественной ПЦР, Б - гистограмма распределения нестин-положительных интактных клеток, В - гистограмма распределения нестин-положительных нейроиндуцированных клетокГистограммы с незаштрихованной областью - неокрашенный контроль. ** p < 0,01.

Отсутствие статистически значимой разницы меж­ду интактными и нейроиндуцированными МСК по экс­прессии нестина на уровне белка может объясняться сле­дующим: серьезной разницы по темпам пролиферации между соответствующими культурами не выявлено.

Таким образом, применение нестина в качестве маркера нейрональной дифференцировки оправдано только в сочетании с другими тканеспецифическими маркерами.