Цель - создание двух новых видов наборов реаген­тов, позволяющих реализовать базисный (1) и модифи­цированный (2) методы определения антирадикальной активности исследуемых жидкостей.

Принцип исследования с использованием базисно­го набора реагентов состоит в том, что АБТС (2,2-ази­но-бис-[3-этилбензтиазолин-6-сульфокислоты] - ди­аммонийную соль) инкубируют с метмиоглобином и Н₂О₂ для образования радикала АБТС⁺, создающего зелено-голубую окраску раствора. Антиоксиданты, на­ходящиеся в тестируемой пробе, подавляют образова­ние окрашенного соединения пропорционально их со­держанию в образце, что позволяет судить о состоянии антиокислительной активности сыворотки (плазмы) крови (и других биологических жидкостей).

Конструкцию набора реагентов составляют:

Реагент А1 - Фосфатный буфер, 1 флакон (50 мл): готов к использованию.

Реагент А2 - хромоген, 5 флаконов. Содержимое одного флакона реагента 2 (А2) растворяют в 10 мл ре­агента 1 (А1).

Реагент А3 - пероксид водорода, 2 флакона (5 мл); к 1 мл содержимого флакона добавляют 1,5 мл реаген­та А1.

Реагент А4 - стандарт, 1 флакон. Содержимое одного флакона реагента 4 (А4) растворяют в 1 мл би­дистиллированной воды.

Исследование осуществляют следующим образом: добавление к 0,9 мл раствора реагента А2, внесенно­го в пробирки для постановки опытной, стандартной и контрольной проб, по 0,02 мл исследуемой биологи­ческой жидкости, стандартного раствора и бидистил­лированной воды (соответственно); после 2-минутной инкубации при 37°С в каждую из пробирок добавляют по 0,3 мл реагента А3 (пероксида водорода). Содержи­мое пробирки тщательно перемешивают, инкубируют при +37°С и измеряют оптическую плотность точно че­рез 3 мин при длине волны 620 нм. Из значения опти­ческой плотности контрольной пробы вычитают соот­ветствующие показатели опытной и стандартной проб.

Рис. 1. - Спектр поглощения АБТС^•+ без антиоскиданта (верхняя кривая) и в его присутствии (нижняя кривая)

Расчет концентрации производят по формуле: С_оп= (ΔA_оп · С_ст)/ΔA_ст,

где

С_оп - показатель, отражающий общую антиради­кальную активность (ОАА) исследуемой биологиче­ской жидкости и выражаемый в размерности молярной концентрации тролокса (trolox).

Исследование антиоксидантной активности биоло­гических жидкостей модифицированным набором ре­агентов (не имеющим мировых аналогов), состоящее в одноэтапной оценке степени восстановления антиок­сидантами предварительно сформированного стабиль­ного радикала АБТС: для его постановки не требуется предварительно создавать специальную систему, про­дуцирующую активные формы кислорода, а вместо 3-х реагентов используется всего лишь один.

Ход определения: к 1,98 мл реагента (внесенного в каждую из трех пробирок) добавляют по 0,02 мл соот­ветствующей пробы (биологической жидкости, раство­ра стандарта, дистиллированной воды) и после 3-ми­нутной инкубации замеряют оптическую плотность.

Расчет производят по формуле: С _оп= (ΔA _оп · С_ст)/ΔA_ст.

Оценка аналитических характеристик тест-систем показала, что значения коэффициента вариации состав­ляют 5-6%, а показатели линейности - 85-115%.

С использованием созданных наборов реагентов исследован биологический материал от 150 пациентов, среди которых 62 с отдельными формами онкологиче­ских заболеваний, 20 - с наличием острой хирургиче­ской патологии, 21 - с отдельными формами сердечно-сосудистой патологии и 47 практически здоровых лиц.

Показатели ОАА в группе сравнения составили 1,056±0,156 (X ±Sх) ммоль trolox/л; в группе пациентов с онкологической патологией - 0,81±0,188, при раке легкого (17 пациентов) - 0,87±0,14, при раке органов желудочно-кишечного тракта (10) - 0,75±0,32; в груп­пе лиц с острой хирургической патологией 0,81±0,26; с сердечно-сосудистой патологией - 0,87±0,125 ммоль trolox/л, что согласуется с источниками литературы.

Результаты исследования сопоставлены с данными, полученными с помощью фотосенсибилизированной хе­милюминесценции на аппарате «ФОТОХЕМ» и аналого­вой тест-системы Randox Kit «Total antioxidant Status».