Острый лейкоз (ОЛ) - наиболее распространенное злокачественное заболевание в детском возрасте. ОЛ имеет генетическую природу, т.е. возникает и развивает­ся в результате генетических нарушений, происходящих в родоначальной кроветворной клетке. Кариотип лейке­мических клеток является одним из важнейших незави­симых прогностических критериев при ОЛ. Выявление хромосомных аберраций позволяет проводить страти­фикацию пациентов для назначения адресной полихи­миотерапии, а также влияет на исход заболевания.

При лейкозах - как остром лимфобластном (ОЛЛ), так и остром миелобластном (ОМЛ) выделяют груп­пу хромосомных перестроек с участием гена MLL (от mixed lineage leukemia, KMT2a, HRX, Htrx-1, ALL-1), расположенного в локусе 11q23. Перестройки с участи­ем гена MLL можно отнести к наиболее распространен­ным аберрациям при гематологических злокачествен­ных новообразованиях. Они выявляются в 5-10% при ОЛЛ детей и взрослых, ОМЛ, миелодиспластическом синдроме и бифенотипическом лейкозе. Наличием пе­рестроек с вовлечением MLL также характеризуются 80% лейкозов у детей до года и 25% вторичных или вы­званных терапией лейкозов. В настоящее время иден­тифицировано свыше 60 генов-партнеров, участву­ющих в таких транслокациях - AF9, AF6, AF10, AF1, AF4, ENL, ELL и др.

Дети с перестройками гена MLL характеризуются неблагоприятным прогнозом. Хотя появляются данные о том, что прогноз может определяться конкретным ти­пом химерного гена (например, пациенты с MLL-AF9 характеризуются более благоприятным течением забо­левания), в целом перестройки гена MLL относятся к неблагоприятным прогностическим признакам.

Анализ перестроек гена MLL имеет существенное клиническое значение для распределения пациентов с лейкозами по группам риска с целью оптимизации те­рапии с учетом неблагоприятного прогноза транслока­ций MLL, а также для мониторинга минимальной оста­точной болезни, т. е. определения остаточных опухо­левых клеток в организме пациента и предупреждения развития рецидива (возврата) заболевания. Поэтому определение типа перестройки гена MLL является не­обходимым условиям успешной терапии.

Методы определения наиболее распространен­ных химерных онкогенов с вовлечением гена MLL. Для выполнения работы нами использовалось несколь­ко подходов к оценке экспрессии основных перестро­ек гена MLL. При первичном поступлении материа­ла -- костного мозга (КМ) пациентов на момент по­становки диагноза проводилось выявление перестро­ек с использованием коммерческого набора Hemavision (Дания). Данный набор рассчитан на выявление 28 хи­мерных генов, распространенных при острых лейко­зах. Этот набор позволял определять экспрессию генов MLL-AF1, MLL-AFX, MLL-AF4, MLL-AF6, MLL-AF9, MLL-AF10, MLL-ENL, MLL-ELL. Методической осно­вой набора послужила статья N. Pallisgaard et al. Па­раллельно проводился анализ с использованием про­токола BIOMED-1, который подтверждает результаты Hemavision в отношении гена MLL-AF4 и дополнитель­но позволяет выявлять редкие варианты этого химерно­го гена. В настоящее время для определения перестро­ек гена MLL при первичных лейкозах в нашей практике используется метод PMRT-PCR, позволяющий в двух реакциях (18 праймеров) определять экспрессию генов MLL-AF4, MLL-AF6, MLL-AF9, MLL-AF10, MLL-ENL, MLL-ELL. Вышеуказанные подходы явились стандар­том для разработки собственного метода, основанно­го на мультиплексной гнездной ПЦР для определения основных клинически значимых перестроек гена MLL при острых лейкозах у детей (Leukogene) (таблица 1).

За период анализа первичных острых лейкозов для диагностики перестроек с участием гена MLL исполь­зовалось несколько методик, которые позволяли опре­делять экспрессию различного набора генов (таблица 1). Результаты, полученные с применением ПЦР, сопо­ставлялись с данными лаборатории цитогенетики. В ряде случаев при отсутствии экспрессии химерных он­когенов первичные лейкозы пациентов в возрасте до 2 лет анализировались методом флуоресцентной гибри­дизации in situ (FISH).

* PMRT - Andersson, HV - Hemavision (DNA-technology, Denmark) основан на статье Pallisgaard, Biomed -Van Dongen, LG (LeukoGene) - разработан­ный нами в период выполнения работы подход, позво­ляющий определять 23 химерных онкогена при острых лейкозах (2012).

Встречаемость и спектр MLL-перестроек при остром лейкозе у детей. В ходе выполнения работы проводился анализ экспрессии перестроек гена MLL с вовлечением различных генов-партнеров в образцах КМ пациентов с ОМЛ, лечившихся в Республиканском научно-практическом центре детской онкологии, гема­тологии и иммунологии с мая 1999 г. по сентябрь 2012 г.

При анализе острых лейкозов перестройки гена MLL с использованием ПЦР были определены у 8,6% (69/802) детей, которым изначально ставился диагноз «острый лейкоз». По причине использования в течение анализируемого периода различных методов - число пациентов, проанализированных на наличие химерных генов, различалось в зависимости от типа гена. Кроме того, в указанную группу не включены лица с M3, вош­ли пациенты из-за рубежа, поэтому реальная встречае­мость перестроек гена MLL может несколько отличать­ся от указанного значения.

При рецидивах ОЛ группы были значительно мень­ше, но встречаемость MLL-позитивных (MLL+) ОМЛ составила 34,7%, а MLL+ОЛЛ - 10,6% (таблица 2). От­мечены также единичные случаи других перестроек с участием гена MLL (MLL-AF1q, MLL-AFX, MLL-AF6). Встречаемость различных перестроек гена MLL по­зволяет отнести эту группу хромосомных аберраций к одной из самых распространенных при остром лейкозе.

Из 97 первичных ОМЛ (не включая M3), 31 (31,9%) характеризовался перестройками гена MLL (табли­ца 3). Следует отметить, что в группу без перестроек вошли пациенты с цитогенетическими доказательства­ми наличия перестроек t(8;21), inv(16) или t(16;16). Таким образом, перестройки гена MLL являются одним из наиболее распространенных типов генетических из­менений при ОМЛ (не-M3) у детей.

Анализ спектра и встречаемости генов-партнеров показал, что наиболее распространенными типами ге­нов являются MLL-AF9 (52%) или MLL-AF10 (23%), ко­торые определяются в 75% случаев. По данным зару­бежных исследований, встречаемость MLL-AF9 варьи­ровала в диапазоне от 31,3 до 61,3%, MLL-AF10 - от 6,5 до 33,3%. 2 пациентов (6%) отмечены гены MLL-AF6 и MLL-ENL, в одном случае определялся MLL-ELL, ци­тогенетически идентичный по локализации гену MLL-ENL. В 2 случаях в качестве партнеров выступали гены семейства септинов - SEPT6 и SEPT9, характерные для ОМЛ, в одном - MLLT11 (AF1q). У пациентов с MLL-AF1q, MLL-SEPT6 и MLL-SEPT9 ген-партнер был иден­тифицирован с использованием анализа точки разрыва на уровне геномной ДНК. Дополнительные цитогене­тические изменения присутствуют в 57% MLL+ ОМЛ, при этом трисомия 8 хромосомы, которая рассматрива­ется как самое распространенное дополнительное ци­тогенетическое изменение, встречается в 17,8% случа­ев (5/28).

При ОЛЛ наиболее распространенными химерны­ми генами с вовлечением MLL были MLL-AF4 (1,9%, 9/462) и MLL-ENL (2%, 7/349), встречались также MLL-AF9 (1,15%4/349,) и MLL-AF10 (0,57%, 2/348), не опре­делялись MLL-AF6 (0/365) и MLL-ELL (0/344). Практи­чески все эти гены были характерны для В-линейного ОЛЛ, в 58,8% лейкозные клетки характеризовались про-В подтипом. При Т-линейном ОЛЛ были отмечены только 2 случая экспрессии MLL-ENL.

Частота встречаемости различных перестроек гена MLL позволяет отнести эту группу хромосомных абер­раций к одной из самых распространенных при остром лейкозе как на момент постановки диагноза, так и при рецидиве. К наиболее распространенным генам-партнерам MLL, определяющимся при MLL+ ОЛ, мож­но отнести гены AF4, AF9, ENL, AF10. Структура ге­нов - их частота и спектр при ОЛЛ в нашем исследова­нии соответствует данным литературы [2].

Особенности межлинейной экспрессии пере­строек с вовлечением гена MLL. Встречаемость раз­личных вариантов перестроек с участием гена MLL различается в зависимости от линейной принадлеж­ности бластных клеток. При ОМЛ преимущественно определяются химерные гены MLL-AF9 и MLL-AF10, при ОЛЛ - MLL-AF4 и MLL-ENL. В то время как MLL-AF4 в нашей работе был обнаружен только при ОЛЛ, гены MLL-AF9, MLL-AF10 и MLL-ENL определяются как при ОМЛ, так и при ОЛЛ, что позволяет предполо­жить вклад вторичных изменений или микроокруже­ния в формировании линейности лейкоза. Следует от­метить, что экспрессия MLL-AF4 описана в отдельных случаях при ОМЛ (1,6%, 13/768 MLL+ ОМЛ). Суще­ствует предположение, что линейная специфичность может быть связана с типом химерных транскриптов. Так, ОЛЛ чаще ассоциирован с перестройками MLL-ENL, в ходе которых MLL сливается c N-концевым участком ENL (bcr1 и bcr3), тогда как при ОМЛ чаще выявляются слияния с С-концевой областью (bcr2 и bcr4).

Распределение перестроек гена MLL в пределах различных подтипов острых лейкозов также неравно­мерно. При ОМЛ в 61 и 71 соответственно экспрессия химерных генов MLL-AF9 и MLL-AF10 определялась при M4/M5 подтипах. При ОЛЛ MLL-AF4 экспресси­ровался при про-В подтипе, MLL-ENL определялся как при В- (на разных стадиях), так и при Т-линейном ОЛЛ (кортикальный Т-ОЛЛ).

Таким образом, нами сделаны следующие выводы:

1. Была проанализирована экспрессия 10 химерных генов с вовлечением гена MLL: MLL-AF4, MLL-AF6, MLL-AF9, MLL-AF10, MLL-ENL, MLL-ELL, MLL-AF1q, MLL-AFX, MLL-AF1P, MLL-AF17. Наиболее распро­страненными генами-партнерами при детских лейко­зах являются AF4, AF6, AF9, AF10, ENL, выявляемые в 26% ОМЛ (не-М3) и в 7,3% ОЛЛ. Структура генов - их частота и спектр при ОЛЛ в нашем исследовании соот­ветствует данным литературы.

2. Встречаемость различных вариантов перестроек с участием гена MLL различается в зависимости от ли­нейной принадлежности бластных клеток. При ОМЛ преимущественно определяются химерные гены MLL-AF9 и MLL-AF10, при ОЛЛ - MLL-AF4 и MLL-ENL.

При рецидивах частота встречаемости MLL+ ОЛЛ составила 12% (n=14), а MLL+ ОМЛ - 34,7% (n=23).