В настоящее время широко изучается возможность использования аберрантной экспрессии генов BAALC, MN1, ERG и WT1 в качестве прогностического фак­тора при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ). Рас­ширение панели молекулярно-биологических марке­ров позволит не только спрогнозировать течение забо­левания, и следовательно, оптимизировать стратифи­кацию пациентов по группам риска, но и увеличит ве­роятность создания новых более эффективных препа­ратов для лечения данного заболевания, имеющих на­правленный характер действия.

Наибольшее внимание при поиске новых кли­нически значимых молекулярных маркеров уделя­ется подгруппе ОМЛ без видимых молекулярно-цитогенетических изменений, что обусловлено высо­кой заболеваемостью (около 20-45% от всех первич­но диагностируемых ОМЛ), внутригрупповой гетеро­генностью, а также отсутствием возможности выбора риск-адаптированной терапии (пациенты с ОМЛ и нор­мальным кариотипом (НК-ОМЛ) относятся к промежу­точной группе риска). При анализе данных литерату­ры оценить прогностическое значение гиперэкспрес­сии генов BAALC, MN1, ERG и WT1 при НК-ОМЛ не представляется возможным, поскольку опубликован­ные результаты противоречивы. Однако большая часть исследований свидетельствует о наличии прогностиче­ской значимости аберрантной экспрессии исследуемых генов, главным образом BAALC и ERG, при НК-ОМЛ как у детей, так и взрослых. Единичные исследования свидетельствуют о наличии неблагоприятной прогно­стической ценности высоких значений экспрессии ге­нов BAALC, MN1, ERG и WT1 при ОМЛ с аберрантным кариотипом.

Цель - изучение особенностей экспрессии генов BAALC, MN1, ERG, WT1 при ОМЛ у детей, а также оцен­ка прогностической значимости аберрантной экспрес­сии этих генов в группах пациентов с ОМЛ, характери­зующихся нормальным и аберрантным кариотипом.

Материалом для исследования послужили образцы костного мозга 51 ребенка с первичным ОМЛ. Распре­деление включенных в исследование пациентов по ци­тогенетическим группам: лейкозные бласты 10 пациен­тов характеризовались наличием транслокации t (8;21), у 1 ребенка - inv (16), у 11 - перестройками 11q23 и у 13 детей лейкозный клон имел нормальный кариотип.

Определение уровня экспрессии генов BAALC, MN1, ERG, WT1 осуществлялось методом полимераз­ной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального време­ни. Анализ проводился в дуплетах с подсчетом средне­го значения Сt для каждого гена. Результаты нормиро­вались по экспрессии внутреннего контроля, в качестве которого был использован ген GUS, и выражались в от­носительном уровне экспрессии гена-мишени. Далее полученные вариационные ряды разбивались по меди­ане на группы с низким и высоким уровнем экспрессии каждого из изучаемых генов.

С целью более рационального использования ре­активов и образцов, а также уменьшения трудоемко­сти исследования была изучена возможность создания мультиплексной ПЦР для амплификации нескольких последовательностей-мишеней в образце. Для каждого из изучаемых генов были подобраны специфичные пары праймеров, а также TaqMan-зонды с определенными ре­портерными красителями (FAM для гена GUS, HEX для гена BAALC, ROX для MN1 и Cy5 для гена ERG).

В процессе выполнения данного этапа работы была проведена амплификация генов GUS, BAALC, MN1 и ERG с использованием сингплексной, дуплексной и квадроплексной ПЦР, содержащей по одному, два и че­тыре набора праймеры/зонд в одной реакционной сме­си соответственно. В качестве матрицы использова­лась кДНК клеточной линии Kasumi-1. Для выявления наиболее оптимального варианта мультиплексной ПЦР был проведен сравнительный анализ значений Ct каж­дого гена, полученных в результате амплификации с использованием сингплексной и мультиплексных ПЦР (таблица 1).

Применение квадроплексной ПЦР характеризуется низкой эффективностью амплификации, что проявля­ется более высокими значениями Ct в сравнении с со­ответствующей характеристикой сингплексных ПЦР. При проведении дуплексных ПЦР в парах GUS - MN1 и BAALC - ERG показатели амплификации остают­ся идентичными таковым при сингплексной ПЦР. Та­ким образом, полученные данные указывают на воз­мож Применение квадроплексной ПЦР характеризует­ся низкой эффективностью амплификации, что прояв­ляется более высокими значениями Ct в сравнении с со­ответствующей характеристикой сингплексных ПЦР. При проведении дуплексных ПЦР в парах GUS - MN1 и BAALC - ERG показатели амплификации остаются идентичными таковым при сингплексной ПЦР. Таким образом, полученные данные указывают на возможность объединения олигонуклеотидов для амплификации ге­нов GUS и MN1, а также BAALC и ERG в одной реакци­онной смеси при использовании метода ПЦР в реаль­ном времени.

Наличие экспрессии гена BAALC было зарегистри­ровано в 98% случаев, гена ERG - в 98%, генов MN1 и WT1 - в 100%. Общая характеристика экспрессии ис­следуемых генов представлена в таблице 2.

Изучение особенностей аберрантной экспрессии в группах с дефектами длинного плеча 11-й хромосомы позволило установить ряд ассоциаций. Так, в группе с аномалиями 11q23 (n=5) были зарегистрированы бо­лее низкие значения экспрессии гена WT1 в сравнении с группой без указанных генетических дефектов (n=32) (р=0,02). Кроме того, низкие значения гена WT1 при ОМЛ ассоциированы с перестройкой MLL-AF9, что графически отражено на рис. 1 (р=0,047).

Примечание. Исследуемые группы: 0 - без реаранжировок гена MLL-AF9 (n=30); 1 - с реаранжировками гена MLL-AF9 (n=4).

В результате исследования установлено наличие не­благоприятного прогностического значения аберрант­ной экспрессии гена WT1 в группе НК-ОМЛ, на что указывают более низкие показатели общей выживае­мости в группе с высокой экспрессией указанного гена (рис. 2). В общей группе, а также в группах пациентов с аберрантным кариотипом статистически значимых закономерностей между уровнями экспрессии генов BAALC, MN1, ERG, WT1 и показателями общей, бессо­бытийной и безрецидивной выживаемости установле­но не было.

Таким образом, наличие экспрессии генов BAALC, MN1, ERG, WT1 зарегистрировано в 98-100% образ­цов. Установлено, что у пациентов с аномалиями 11q23 (р=0,02), в частности с реаранжировкой MLL-AF9, на­блюдается более низкая экспрессия гена WT1 (р=0,047). Высокая экспрессия WT1 ассоциирована с худшей об­щей выживаемостью в группе ОМЛ с нормальным ка­риотипом (р=0,03). Прогностической значимости абер­рантной экспрессии генов BAALC, MN1, ERG в иссле­дуемой группе не установлено.

На основании полученных данных можно сделать вывод о наличии клинического значения гиперэкспрес­сии гена WT1, а также о возможности использования данного молекулярно-биологического маркера в каче­стве прогностического у детей с ОМЛ без видимых ци­тогенетических изменений. Особый интерес аберрант­ная экспрессия WT1 представляет с точки зрения от­слеживания минимальной остаточной болезни. Кроме того, WT1 является одной из наиболее перспективных мишеней для направленной терапии ОЛ. В настоящее время проводятся клинические испытания пептидной вакцины на основе WT1, а также вакцины на основе дендритных клеток, активированных пептидами WT1.