УДК: 616.24-002.5:612.017.1
Год издания: 2015

Метод иммунотерапии пациентов с хронической обструктивной болезнью легких и идиопатическим фиброзирующим альвеолитом с использованием аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

Лицкевич Л.В.Гуревич Г.Л.Скрягина Е.М.Скрягин А.Е.Шпаковская Н.С.Новикова М.А.
Рубрики: 76.29.35
Республиканский научно-практический центр пульмонологии и фтизиатрии
Тема НИР: «Разработать метод иммунотерапии пациентов с хронической обструктивной болезнью легких и идиопатическим фиброзирующим альвеолитом с использованием аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК)».
Сроки выполнения НИР: январь 2014 г. — декабрь 2015 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. Г.Л. Гуревич.
Источник финансирования: госбюджет.

При хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) имеет место ослабление эластических свойств легких, что, в свою очередь, приводит к феномену их гиперинфляции с образованием «воздушных ловушек» в легких, а при идиопатическом фиброзирующем альвеолите (ИФА) - избыточное фиброзообразование в легких в ответ на неспецифическое повреждение эпителия. Одним из ключевых факторов неблагоприятного течения ХОБЛ, ИФА является снижение иммунного статуса. Данные механизмы служат основной причиной развития тяжелой хронической дыхательной недостаточности, являющейся инвалидизирующим осложнением и частой причиной смерти данных категорий пациентов во всем мире. К сожалению, в настоящее время не существует вмешательств, благодаря которым было бы достоверно доказано продление выживаемости пациентов с ХОБЛ, ИФА.

Одним из наиболее перспективных, инновационных направлений современной науки считается регенеративная медицина, связанная прежде всего с использованием стволовых клеток (СК). Последние годы в большинстве развитых стран отмечены активным переходом от экспериментальной фазы к клиническим исследованиям в данной области. На начало 2012 г. в международной базе данных Clinical Trials зарегистрировано 3672 клинических исследования у человека, связанных с СК. Благодаря доказанному А.А. Максимовым и А.Я.Фриденштейном иммунорегуляторному эффекту ММСК появилась возможность обеспечить существенную защиту при легочных заболеваниях, в т.ч. при ХОБЛ, астме, легочной гипертензии, а также научно обосновать терапевтическое использование ММСК при идиопатическом легочном фиброзе. Установлено, что терапия ММСК модулирует оксидативный стресс. Замедление темпов прогрессирования легочной деструкции, ремоделирование или восстановление разрушенных структур легких является перспективной стратегией лечения ХОБЛ. В отличие от животных моделей регенерация легких человека при ХОБЛ с использованием фармакологических средств трудна. Регенерация СК легочной ткани из эндо- и экзогенных источников является перспективным феноменом в ведении такого грозного осложнения, как дыхательная недостаточность.

Разработка метода иммунотерапии пациентов с ХОБЛ и ИФА основана на применении ММСК на фоне базисной терапии этих заболеваний и позволяет выявить признаки повышения толерантности к физической нагрузке и интегральных параметров качества жизни в отдаленном периоде после трансплантации ММСК, а также обнаружить изменения иммунитета на этапах прогрессирования болезни. Особенностью ММСК является не только потенциальная возможность их трансформации в гетерогенные клетки разных органов, получившая название пластичности, но и способность самостоятельно или опосредованно индуцировать продукцию ряда активных медиаторов разнообразных процессов - воспаления, фиброза, регенерации - цитокинов, факторов роста и их ингибиторов, ферментов и др. (паракринная активность).

На базе пульмонологического отделения ГУ «РНПЦ пульмонологии и фтизиатрии» в контролируемое рандомизированное, проспективное с двойным контролем исследование включено 56 пациентов, в т.ч. 37 человек с ХОБЛ и 19 - с ИФА. Основную группу сформировали 10 пациентов, в т.ч. семь с ХОБЛ и трое с ИФА, медиана возраста которых составила: 55 (44; 64) и 65 (52; 67) соответственно. Всем пациентам основной группы были проведены: прокол подвздошной кости с забором костного мозга (КМ), процессинг, культивация и реинфузия ММСК на фоне базисной терапии основных заболеваний; изучали характеристики КМ в качестве источника ММСК.

Из костного мозга путем центрифугирования при 400 g на градиенте плотности Histipague (плотность 1,077 г/см3) в течение 30 мин была выделена фракция мононуклеарных клеток в количестве в среднем 190*106МНК. После 2-3 недель культивирования ММСК открепляли с поверхности флаконов с помощью трипсин-EDTA, дважды отмывали в физиологическом растворе. Клетки были ресуспензированы в 20 мл 9% раствор NaCl, набраны в шприц и отданы для введения пациентам внутривенно.

Проведено иммунофенотипическое исследование полученной культуры клеток. Установлены следующие маркеры, экспрессируемые на поверхности ММСК: CD105, CD90, CD73. Маркеры CD14, CD34, CD45 не экспрессируются мезенхимальными клетками, что отличает их от ГСК. Результаты иммунофенотипирования культивированных аутологичных клеток пациентов с ХОБЛ и ИФА свидетельствуют о наличии поверхностных CD-кластеров, характерных для ММСК, уровень которых был более 90%. Экспрессии маркеров ГСК не наблюдалось.

Согласно разработанной программе клинических испытаний оценка основных параметров гемодинамики и газообмена проводилась на 60 и 150-й дни после реинфузии ММСК. Группу сравнения составили 46 пациентов, которым проводилась базисная терапия основных заболеваний, в т.ч. 30 с ХОБЛ и 16 с ИФА, медиана возраста которых составила: 61,9 (45; 69) и 59,5 (39; 74) соответственно. В настоящее время произведена пункция костного мозга 14 пациентам, выполнен процессинг и культивация ММСК; осуществлен посттрансплантационный мониторинг у 10 человек через 5-7 дней, 1,5-2 мес., 4,5-5,5 мес. после введения ММСК, а также у 6 - в отдаленный период через 7-10 мес.

Таблица - Характеристика пациентов, включенных в исследование

В основной группе было 7 пациентов с диагнозом ХОБЛ, в т.ч. среднетяжелого течения - 3 (42,9%) и тяжелого - 4 (57,1%). Трое пациентов с ИФА имели прогрессирующее течение, в т.ч. легкое с ДН I стадии - один, среднетяжелое с ДН II стадии - один и тяжелое с ДН II-III стадии - один.

По соглашению ATS/ERS/JRS/ALAT ведущими критериями при установлении диагноза ИФА было наличие 4-х положительных критериев категории А и 3-х - категории Б: А. Большие - исключение других ИЗЛ, вызванных известными причинами; рестриктивные нарушения ФВД и изменения ДЛСО; двусторонние ретикулярные изменения в базальных отделах легких, симптом «матового стекла»; отсутствие признаков альтернативного диагноза по данным ТБС, БАЛЖ; Б. Малые: возраст более 50 лет, одышка при ФН, длительность болезни более 3 мес.; инспираторная крепитация в базальных отделах легких.

Клинически все пациенты с ХОБЛ предъявляли жалобы на кашель с трудно отделяемой мокротой, одышку при умеренной (42,9%) и незначительной (57,1%) физической нагрузке, медиана степени выраженности одышки по шкале МRC составила 4 (3;5) балла. Пациентов с ИФА беспокоила одышка при умеренной (33,4%), незначительной физической нагрузке (33,3%) и в покое (33,3%), медиана степени выраженности одышки по шкале МRC составила 4 (3;5) балла. У всех пациентов с ИФА при аускультации выслушивалась крепитация в нижних отделах на фазе вдоха (100,0%).

Пациенты основной группы были сопоставимы по возрасту, полу, наличию факторов риска. При спирометрии у всех пациентов группы сравнения (ХОБЛ) выявлены выраженные обструктивные нарушения, что проявлялось снижением ОФВ1 до 59,1±2,9% и соотношения ОФВ1/ЖЕЛвд до 68,7±2,6%. У пациентов основной группы с ХОБЛ установлены резкие обструктивные нарушения, что проявлялось уменьшением ОФВ1 до 40,7±1,3% (р<0,001 по по отношению к группе сравнения с ХОБЛ) и соотношения ОФВ1/ЖЕЛвд до 49,4±1,5 (р<0,001 по отношению к группе сравнения с ХОБЛ). Значительное снижение у пациентов основной группы (ХОБЛ) легочных объемов - МОС75 до 22,8±2,1%, МОС50 до 12,1±1,8%, (р<0,001), МОС25 до 12,1±1,7% (р<0,01) свидетельствует о развитии у них хронической дыхательной недостаточности II стадии.

У пациентов основной группы с ИФА установлены рестриктивные нарушения функции внешнего дыхания, что характеризовалось нормальными уровнями ОФВ1 85,3±1,1% (р<0,001, в группе сравнения - 64,7±1,9%), соотношением ОФВ1/ЖЕЛвд 104,2±0,8 (в группе сравнения - 102,4±0,9%), МОС75 120,9±7,4% (р<0,001, в группе сравнения - 92,1±2,8%), МОС50 до 87,5±3,1% (р <0,001, в группе сравнения - 64,2±2,9%) и снижением легочных объемов на уровне крупных бронхов - МОС25 до 43,5±8,2% (в группе сравнения 35,5±2,6%), что свидетельствует о наличии признаков дыхательной недостаточности и обусловлено интерстициальным фиброзом.

При исследовании показателей бодиплетизмографии выявлено увеличение внутригрудного объема (ВГО) до 149,2±6,5 у пациентов группы сравнения (ХОБЛ) и до 191,4±2,4% у пациентов основной группы (ХОБЛ) (р<0,001 по отношению к группе сравнения с ХОБЛ. Наблюдается также значительное увеличение остаточного объема (ОО) до 253,0±4,3% у пациентов основной группы (р<0,01, в группе сравнения с ХОБЛ - 190,7±8,5%) и соотношения ОО/ОЕЛ до 173,6±1,8% у пациентов основной группы (ХОБЛ) (р <0,01, в группе сравнения с ХОБЛ - 109,9±3,2%).

Остаточная емкость легких (ОЕЛ) также имела тенденцию к увеличению до 142,1±1,5% у пациентов основной группы (ХОБЛ) (р<0,01, 127,4±2,5% в группе сравнения с ХОБЛ).

У пациентов группы сравнения (ХОБЛ) наблюдается увеличение остаточного объема (ООдиф) до 126,4±6,1 и соотношения (ОО/ОЕЛдиф) до 123,2±5,0, обусловленное наличием синдрома легочной гиперинфляции. Уменьшение диффузионной способности легких (ДЛСО) до 54,2±8,5% (р<0,05, в группе сравнения с ХОБЛ - 76,6±5,8) и соотношения ДЛСО/АО до 67,6±6,7% у пациентов основной группы (ХОБЛ) (р<0,05, в группе сравнения с ХОБЛ - 80,1±5,3%) обусловлено снижением числа функционирующих альвеол и поверхности функционирующей легочной ткани.

У пациентов группы сравнения и основной группы с ИФА наблюдается более резкое, чем у пациентов с ХОБЛ более чем в 2 раза уменьшение диффузионной способности легких (ДЛСО) до 37,6±9,1 и 36,7±14,9% соответственно.,

У пациентов основной группы с ХОБЛ на фоне прогрессирования легочной гиперинфляции (значительное увеличение показателей ВГО и соотношения ОО/ОЕЛ) имеют место функциональные нарушения сердечной мышцы в виде диастолической дисфункции ЛЖ I типа на фоне умеренной легочной гипертензии. У пациентов с ИФА на фоне рестриктивных нарушений механики дыхания и прогрессирования расстройств диффузионной способности легких (снижение ДЛСО и ДЛСО/АО) имеют место функциональные нарушения сердечной мышцы в виде диастолической дисфункции ЛЖ II типа и умеренной легочной гипертензии.

Для ИФА наиболее характерными являются следующие изменения в легочной ткани: интерстициальный фиброз в виде утолщения межальвеолярных перегородок, симптом «матового стекла», очагово-тяжистые элементы на фоне сгущенного легочного рисунка, фиброзирование корней легких.

У пациентов с ХОБЛ основной группы отмечались тенденция к снижению показателей Т-клеточного иммунитета: уменьшение общего количества Т-клеток (CD3+) до 66,5±2,0% (р<0,05), Т-супрессоров (CD8+) до 22,3±3,7% (р<0,01) в сравнении с группой практически здоровых лиц. Количество В-лимфоцитов (CD19+) значимо не отличалось у пациентов с ХОБЛ по сравнению с группой здоровых лиц (16,0±6,4 и 10,7±0,4% соответственно, р>0,05).

Оценка результатов иммунофенотипирования клеток крови у пациентов группы сравнения с ХОБЛ в сопоставлении с группой практически здоровых лиц выявила различия по содержанию CD4+ (статистически значимо ниже при ХОБЛ - 37,9±2,0%, р<0,01), по более высокому уровню естественных киллеров (CD16+56+ 17,9±1,5, р<0,01 и CD3+16+56+ 6,3±0,9%, р<0,05).

Результаты иммунофенотипирования клеток крови у пациентов основной группы с ИФА свидетельствовали о резких изменениях показателей Т-клеточного иммунитета: снижение общего количества Т-клеток (CD3+) до 52,4±2,1% (р<0,05), Т-хелперов (CD4+) до 24,9±1,9 (р<0,001 по сравнению с основной группой с ХОБЛ и группой здоровых лиц). Количество В-лимфоцитов (CD19+) было ниже на 54,2% у пациентов основной группы с ИФА (4,7±0,9 и 10,7±0,4% соответственно, р<0,01 по сравнению с группой здоровых лиц). Иммунорегуляторный индекс (СД4/СД8) у пациентов основной группы с ИФА был снижен до 1,2±0,1 (р<0,01 по сравнению с группой, имеющей ХОБЛ).

Межгрупповой анализ иммунофенотипа клеток крови пациентов основных групп с ХОБЛ и ИФА выявил достоверные более значимые изменения Т-лимфоцитов и резкое снижение количества В-лимфоцитов более чем в 3 раза (р<0,01), что может служить обоснованием для иммунотерапии аутологичными ММСК, в т.ч. с 2-3-кратным повторным введением. Это позволяет получить важную информацию о механизмах иммунного воспаления при ХОБЛ и ИФА и может быть использовано для разработки показаний к иммунотерапии с применением аутологичных ММСК.

Завершен посттрансплантационный мониторинг 10 пациентов, которые отмечали субъективное улучшение клинического состояния (общее самочувствие, интегральные показатели качества жизни, уменьшение одышки) и снижение признаков дыхательной недостаточности в ходе курса восстановительного лечения.


Область применения: терапия, пульмонология.
Рекомендации по использованию: метод может применяться в учреждениях здравоохранения республики.
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь при внедрении.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2020 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта