Вместе с огромным количеством работ в области терапевтических антител, имеющих каноническое строение на основе IgG человека, в последние 10-12 лет нарастает поток исследований, посвященных изучению коротких антигенсвязывающих белков неканонического иммуноглобулинового строения, прежде всего, однодоменных антител на основе иммуноглобулинов семейства верблюжьих. При сохранении иммуноглобулинового типа фолдинга антигенсвязывающие домены верблюжьих антител несут существенные отличия: во-первых, на уровне четвертичной структуры (способа ассоциации доменов) и, во-вторых, на субдоменном уровне - структуре антигенсвязывающих сегментов.

Если канонические антитела содержат 2 легких (L) и 2 тяжелых H-цепи при молекулярной массе около 150 кДа (иммуноглобулины G), то неканонические антитела с молекулярной массой 75-80 кДа лишены легких цепей и являются гомодимерами Н-цепи. При этом Н-цепь укорочена на первый константный домен СН1, известный своей гидрофобностью. Отсутствие этого домена позволяет Н-цепи верблюжьих антител сохранять растворимость в отсутствие L-цепи, которая в канонических антителах играет роль внутримолекулярного «солюбилизатора» плохо растворимой Н-цепи.

Поскольку за связывание антигена в неканонических антителах отвечает один домен, в начале XXI в. были получены рекомбинантные однодоменные белки, обозначаемые как VHH и сохраняющие антигенсвязывающую функцию. Их использование вместо канонических антител радикально уменьшило число структурных вариантов для белковой инженерии и этим намного упростило задачу, поскольку для оптимизации канонических конструкций необходима инженерия антигенсвязывающих участков двух доменов, затем оптимизация 2-х типов междоменных контактов - латеральных, между двумя вариабельными доменами, и контактов вариабельных доменов с константными, после чего дополнительно необходима минимизация гидрофобных поверхностей конечной конструкции.

Работы с однодоменными антителами ведутся для биотехнологии, а также получения более сложных кандидатных конструкций для терапии, несущих одну или несколько функций: бивалентность, биспецифичность, пролонгированная за счет добавленных структур персистенция в кровотоке, присоединение токсического модуля для индукции апоптоза клетки-мишени.

Для однодоменных антител прогнозируется ряд преимуществ по сравнению с каноническими антителами, включая большую стабильность, гидрофильность, терморезистентность, меньшую иммуногенность для человека, что в сумме перекрывает закономерно сниженную (на 1-2 порядка) аффинность по сравнению с полноразмерными каноническими антителами. Однако эти прогнозы основаны на данных лабораторий, заинтересованных в продвижении неканонических однодоменных антител, и требуют независимого подтверждения.

Цель- сравнение основных характеристик неканонических однодоменных антител и доменов канонических антител по параметрам конформации, стабильности и антигенсвязывающей активности.

Из набора первичных структур VHH доменов неканонических антител, опубликованных лидирующей компанией Ablynx (Бельгия), были выбраны и синтезированы химико-энзиматическим методом сплайсинга 3 последовательности, обозначенные как 2А4, 2D3, 2A6. Критерием выбора служили: i) максимальное совпадение с наиболее часто встречаемой последовательностью аминокислот в каркасной (framework) области VHH доменов и ii) высокие значения констант связывания антигена HER2/neu. Длина исходных последовательностей VHH составляла: 120 аминокислот (2А4), 124 (2A6) и 123 (2D3). С учетом добавленного N-концевого Met и гексагистидинового пептида на С-конце первичная структура VHH доменов включала 127, 131 и 130 аминокислот.

В качестве минимальной антигенсвязывающей структуры канонических антител использован двухдоменный белок scFv, включающий вариабельные домены VL и VH терапевтического антитела 4D5 (трастузумаба), имеющего каноническую структуру и направленного против онкомаркера HER2/neu. Белок scFv содержит междоменный линкерный пептид, связывающий два вариабельных домена в единую полипептидную цепь, и С-терминальный сегмент с гексагистидиновым «тэгом». Плазмида с геном scFv4D5 предоставлена С.М. Деевым (д-р биол. наук, зав. лабораторией молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН, Москва).

На основе экспрессионных векторов pET23d для белка scFv4D5 и pET-22b(+), для VHH белков и бактериального штамма E.coli BL21(DE3) созданы системы гетерологической экспрессии. Экстракцией из телец включения, ренатурацией и хроматографической очисткой антител получены гомогенные белки со степенью очистки не менее 95% в количествах до 20-30 мг за один цикл выделения.

Определены физико-химические характеристики антител методами флуоресцентной спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии, аналитической гель-хроматографии и электрофореза. Показано, что все белки при физиологических условиях являются мономерами с молекулярной массой, соответствующей расчетной - 29,2 кДа для канонического антитела scFv4D5 и 14,0-14,5 кДа для трех VHH антител.

Конформационную стабильность белков анализировали в условиях рН-зависимых переходов методами собственной флуоресценции белка и связывания внешнего флуоресцентного зонда АНС (1-анилино-8-нафталиносульфоната). Показаны некритические отличия рН-стабильности 2-х классов антител.

Для scFv4D5 зарегистрированы локальные изменения третичной структуры с участием ароматических флурофоров в диапазоне рН 4,5-3,5, в то время как третичная структура VHH в этом диапазоне стабильна и не испытывает локальных изменений. Компактная конформация сохраняется также при рН 2, что свидетельствует о рН-стабильности обеих групп антител, свойственной большинству иммуноглобулинов. При дальнейшем снижении рН в диапазоне рН 3,5-2,0 для обеих групп антител наблюдается экспонирование части гидрофобных участков, связывающих флуоресцентный зонд АНС, без потери общей компактности молекулы.

Количественные данные о третичной структуре антител и ее стабильности получены с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Исходя из параметров тепловых переходов в диапазоне 10-100°С обе группы антител имеют компактную третичную структуру с температурой полуперехода Tm = 60°С для VHH и 67°С для scFv4D5 при рН 7. Однако энтальпия денатурации Δh значительно выше для VHH антител: от 5 до 7,5 кал/г для 3-х VHH белков против Δh = 3,0-3,5 кал/г для scFv4D5 белка.

Сравнение величин энтальпии термоденатурации 2-х классов антител показывает, что по термодинамической стабильности VHH антитела значительно превосходят канонические. Полученные величины Δh численно близки к значениям, характерным для полноразмерных 12-доменных канонических антител, в которых дополнительным и существенным стабилизирующим фактором являются междоменные взаимодействия. Однако неканонические VHH домены имеют близкую или даже большую термодинамическую стабильность однодоменной структуры, что является несомненным преимуществом VHH антител и делает их привлекательным объектом генно-инженерного конструирования для биомедицинских технологий.

Вторым радикальным отличием и преимуществом неканонических антител является значительная степень обратимости тепловых переходов. Для доменов канонических антител она очень мала при кислых рН либо отсутствует в нейтральных рН, а для VHH доменов неканонических антител обратимость в использованных нами условиях составляет 40-60%. Целевой поиск сольвентных условий может дать большие величины обратимости тепловых переходов. В то же время термостабильности канонических и неканонических антител в терминах температуры полуперехода T_m весьма близки. Этот вывод не согласуется с заключением о большей термостабильности неканонических антител, сделанным в ряде обзорных публикаций.

Методом проточной цитофлуориметрии с применением линии HER2/neu-экспрессирующих клеток SKBR-3 и меченных изотиоцианатом флуоресцеина белков scFv4D5 и VHH оценена равновесная константа связывания с рецептором HER2/neu, имеющая величину Касс = 2•10⁷ М^-1 (Кдисс = 5•10^-8 М) при степени модификации 5,0 моль флуоресцеина на 1 моль белка scFv4D5. Эта величина уступает лишь 1 порядок константе связывания исходного полноразмерного антитела 4D5 (трастузумаба), что является обычным результатом при укорочении структуры до scFv фрагмента. Близкие величины Касс получены и для неканонических антител: Kасс = 2•10⁷ М^-1 и 5•10⁷ М^-1 для 2-х различных последовательностей белков при степени модификации 0,9-1,1 моль флуоресцеина на 1 моль белка и Kасс = 4•10⁶ М^-1 при степени модификации 2,5 моль флуорофора на 1 моль белка. Эти данные свидетельствуют о близкой функциональной эффективности антигенсвязывающих доменов неканонических и канонических антител.