Широкое применение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в терапевтических протоколах лечения требует процедуры накопления клеточной массы in vitro, достаточной для клинического применения. Большинство предложенных на сегодняшний день способов размножения клеток in vitro основано на использовании в составе среды для культивирования компонентов животного происхождения. Традиционно как источник ростовых факторов, обеспечивающих жизнедеятельность и пролиферацию в культуре, применяется эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) в концентрации 5-20%. Однако использование ксеногенных добавок при приготовлении клеточных продуктов, предназначенных для введения пациентам, в большинстве высокоразвитых стран запрещено. Одним из оснований является высокая вероятность попадания в организм реципиента ксеногенных белков, не полностью утилизированных в процессе жизнедеятельности клеток. Другая опасность использования ЭТС заключается в возможности инфицирования клеток и, соответственно, их реципиента зоонозными инфекциями или агентами прионной природы. С целью повышения биологической безопасности МСК, применяемых в практической медицине, в качестве альтернатив используются среды с синтетическими факторами роста либо сывороткой крови человека (аутологичной или донорской). Показано, что применение таких сред не только увеличивает продукцию МСК, но и улучшает их регенеративные свойства и пролиферативный потенциал, а также обусловливает возможность создания технологии эффективного культивирования МСК человека и разработки клеточных препаратов на их основе, пригодных для безопасного клинического применения.

Цель - разработать технологию получения сыворотки АВ (IV) группы из донорской крови для культивирования клеток животных и человека in vitro.

Сущность достижения: разработана технология получения сыворотки АВ (IV) из крови человека для культивирования клеток человека и животных in vitro.

В качестве материала для отработки технологии получения сыворотки АВ (IV) группы крови по системе АВ0 была использована кровь доноров группы АВ (IV), забранная в стерильные флаконы без антикоагулянта с соблюдением мер асептики в процессе забора, резус-положительная, апробированная на наличие маркеров инфекционных заболеваний методом молекулярно-генетического анализа (ПЦР), HLA-антител, с отсутствием гемолиза и хилеза.

Сыворотку АВ (IV) группы получали из крови 20 донорских доз. После образования сгустка кровь центрифугировали, сыворотку отбирали, объединяли от разных доноров и подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации, дозировали в стеклянные флаконы, замораживали и хранили при -20° С до использования. Контролировали полученную сыворотку на микробиологическую стерильность методом прямой инокуляции питательной среды в соответствии с требованиями ГФ РБ II, т. 1, 2.6.1 и отсутствие маркеров вирусов гепатита В, С, ВИЧ методом амплификации нуклеиновых кислот в соответствии с требованиями ГФ РБ II, т. 1, 2.7.1 и ГФ РБ II, т. 1, 2.6.21. Были исследованы также физико-химические показатели сыворотки (прозрачность, цветность, специфичность, осмоляльность, остаточный гемоглобин, белок, биологическая активность). Биологическую активность сыворотки изучали на культурах мезенхимальных стволовых клеток 2-го пассажа, полученных из жировой ткани, пуповины, костного мозга. В качестве контроля использовали эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) HyClone Thermo (США). МСК высевали во флаконы Т-25 (Sarstedt, ФРГ) в количестве 3000 кл/см² в 5,0 мл полной питательной среды (ППС) α-МЕМ (Lonza, Швейцария) с добавлением 5% АВ (IV) сыворотки (опыт) и 10% ЭТС (контроль). Клетки культивировали в течение 7 сут в углекислотном инкубаторе при температуре +37° С и 5% содержании СО2 с заменой среды на 4-е сут. В течение всего периода культивирования (7 сут) микроскопически исследовали морфологию МСК. Жизнеспособность клеток (ЖСП) оценивали с помощью окрашивания и подсчета клеток в 0,1% растворе трипанового синего. Через 7 сут клетки снимали 0,25% раствором трипсина-ЭДТА. Количество клеток и ЖСП оценивали в камере Горяева.

Полученная сыворотка АВ (IV) группы представляла собой прозрачную опалесцирующую жидкость желтого цвета без признаков гемолиза и агглютинации с соответствующим антигеном.

За период культивирования клетки достигали 70-75% плотности роста. При микроскопии выявлено, что они имели вид вытянутых веретенообразных клеток фибробластоподобной формы, характерной для МСК. Результаты экспансии МСК и ЖСП представлены в таблице.

Таблица - Кратность увеличения экспансии МСК и ЖСП

Примечание: ИП* кратность увеличения клеток по отношению к первоначально высеянной дозе клеток.

Данные исследования биологической активности сыворотки АВ (IV) показали, что количество МСК во флаконах, содержащих ППС с 5% сыворотки АВ (IV), увеличилось относительно первоначально внесенных клеток в 3,5; 4,3 и 7,5 раза, а во флаконах, содержащих ППС с 10% ЭТС - в 1,5; 2,1 и 2,8 раза за весь период культивирования.

Жизнеспособность МСК костного мозга, пуповины и жировой ткани при наращивании в ППС с 5% АВ (IV) в среднем составила 96%, а в ППС c 10% ЭТС - 95,5%.

Сыворотка АВ (IV) в составе ППС для наращивания МСК обеспечивает сохранение морфологии и поддерживает пролиферативный потенциал клеток. По эффективности прироста клеточной массы превосходит ЭТС и может быть использована для эффективного культивирования МСК человека и разработки клеточных препаратов на их основе, пригодных для безопасного клинического применения.

В результате исследований разработаны технология получения сыворотки АВ (IV) группы из донорской крови, технологический регламент и получено регистрационное удостоверение.