В исследованиях последних лет показано, что гемопоэтические стволовые клетки периферической крови, костного мозга, фетальной печени и пуповинной крови можно дифференцировать в эритроидном направлении in vitro до стадии утраты клеточного ядра (ретикулоциты, эритроциты) (Migliaccio G., 2002, Baek E., 2008, Neildez-Nguyen T., 2002, Pourcher G., 2011). Условия культивирования существенно отличаются в различных исследованиях как по времени (от 18 до 38 дней), так и по использованию стимулирующих эритропоэз компонентов среды (цитокинов, плазмы и сыворотки крови и др.). Однако для полной дифференцировки рядом исследователей показана необходимость культивирования эритробластов на поддерживающем подслое, в качестве которого могут быть использованы культуры макрофагов, мезенхимных стромальных клеток (МСК), или эндотелиальных клеток (Hanspal M., 1994, Fujimi A., 2008, Zaid T., 2013, Baek E., 2008). Источниками МСК для описанных исследований являлись костный мозг и пуповинная кровь. Известно, что МСК пуповинно-плацентарного происхождения способны поддерживать экспансию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) in vitro, однако их способность стимулировать эритропоэз в культуре изучена слабо.

Показано, что ГСК пуповинной крови в десятки раз более эффективно подвергаются эритроидной дифференцировке в сравнении с Г-КСФ-мобилизированными ГСК периферической крови (Fujimi A., 2008, Giarratana M., 2011). ГСК пуповинной крови обладают высоким пролиферативным потенциалом, а их дополнительным преимуществом является доступность и безопасность получения исходного биоматериала, который в нашей республике, в основном, подвергается утилизации.

Цель- изучить условия эффективной направленной эритроидной дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека in vitro в присутствии МСК пуповинно-плацентарного происхождения и МСК КМ.

Методом количественной ПЦР в МСК пуповины, плаценты и КМ изучали уровень экспрессии генов основных цитокинов, регулирующих созревание ГСК в миелоидном направлении: гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (g-csf), эритропоэтин (epo), интерлейкин-6 (il-6), интерлейкин-11 (il-11). Уровень экспрессии il-6 был самым высоким, однако, аналогично epo, не имел статистически значимых отличий в МСК из всех трёх источников. При этом выявлено, что уровень мРНК гена g-csf в МСК пуповины был на три порядка выше, в сравнении с МСК КМ (р<0,03), что может инициировать преимущественное направление in vitro дифференцировки ГСК в гранулоцитарно-моноцитарном направлении в присутствии МСК пуповины.

Способность МСК из разных источников поддерживать эритропоэз in vitro изучали путем сокультивирования с ГСК без внесения в среду рекомбинантных цитокинов, регулирующих созревание в эритроидном направлении. На стромальном подслое клеток пуповины наблюдали достоверное (p=0,008) увеличение доли гранулоцитарных и моноцитарных предшественников, тогда как сокультивирование с МСК КМ не приводило к смещению субпопуляционного состава гемопоэтических предшественников. В присутствии МСК плаценты происходило наибольшее увеличение доли CD36⁺ клеток пуповинной крови, обладающих потенциалом к эритроидной дифференцировке (с 11±3% до 50±10%) и сохранялось больше эритроидных колониеобразующих единиц в сравнении с МСК пуповины. Таким образом, было показано, что МСК плаценты больше подходят для эритроидного направления дифференцировки ГСК, чем МСК пуповины.

Для того, чтобы уменьшить влияние секретируемых МСК цитокинов, направляющих дифференцировку ранних стволовых клеток в гранулоцитарно-моноцитарном направлении, сокультивирование с МСК КМ или плаценты использовали на более поздних этапах (с седьмых суток) эритроидной in vitro дифференцировки. Сокультивирование проводили в течение 10 дней в присутствии рекомбинантных эритропоэтина и интерлейкина-3. Показано увеличение количества эритроидных клеток более чем 16 000 раз в присутствии МСК КМ и более 1600 раз в присутствии МСК плаценты. Исходная популяция клеток имела фенотип CD34⁺CD45⁺CD235a^-, около 10% клеток были положительны по CD36 и 70% - по CD71. При созревании кроветворных клеток экспрессия поверхностных кластеров дифференцировки менялась следующим образом: к 11-му дню популяция имела фенотип CD34^-/36⁺/71⁺/235a⁺, содержание панлейкоцитарного маркера CD45 уменьшилось до 16%. К 17-му дню популяция состояла из клеток, находящихся на разных стадиях созревания. Менее зрелые клетки все еще экспрессировали CD36, тогда как более дифференцированные клетки уже утратили этот маркер. Иммунофенотип основной массы клеток был CD34^-/45^-/71⁺/235a⁺. Данный фенотип характерен для эритроидных предшественников на поздних стадиях созревания.

Для более точного определения стадии созревания клеток были проведены цитологические исследования. Количество оксифильных нормобластов (стадия созревания, предшествующая стадии ретикулоцита) составляло 88% в случае совместной культуры с МСК КМ и 78% с МСК плаценты. Доля безъядерных клеток, среди которых могут содержаться как ретикулоциты, так и эритроциты в первом варианте дифференцировки составляла 37%, во втором - 17%.

Таким образом, показано, что МСК КМ, пуповины и плаценты при использовании на ранних этапах экпансии и дифференцировки способствуют коммитированию ГСК в гранулоцитарно-моноцитарном направлении, причем в наибольшей степени эта способность проявляется для МСК пуповины. На этапе созревания эритроидных предшественников МСК КМ способствуют большему увеличению их количества, чем МСК плаценты.