Цель- установление роли β_III-тубулина в жизнеспособности, ростовых и инвазивных свойствах, а также химиорезистентности опухолевых клеток колоректального рака человека.

В Республике Беларусь колоректальный рак (КРР) занимает третье место как причина онкологической смертности. Важнейшими факторами, обусловливающими высокую смертность пациентов с этой опухолью, является ее низкая чувствительность к химиотерапии; так 5-летняя выживаемость поциентов с отдаленными метастазами на фоне проводимой химиотерапии не превышает 1%, а также и высокий процент метастазов и рецидивов. По данным отечественных и зарубежных авторов к моменту постановки диагноза около 25% пациентов уже имеют метастазы, а примерно у 50% метастазы развиваются в дальнейшем. Одним из подходов к лечению является использование химиотерапевтических препаратов, блокирующих митотическое веретено и подавляющих деление клеток. Молекулой-мишенью таких препаратов является β-тубулин - компонент микротрубочек, структур, необходимых для клеточного деления, внутриклеточного транспорта, поддержания формы клетки и ее тургора. Различные изменения в составе тубулинов происходят в канцерогенезе как солидных, так и гематологических опухолей. Эти изменения часто ассоциированы с химиорезистентностью и плохим прогнозом для целого ряда нозологий. Наиболее изученным и важным в практическом аспекте является экспрессия β_III-тубулина (TUBBIII). Интенсивно изучается потенциальная роль β_III-тубулина как маркера плохого прогноза и ответа на широкий круг цитостатических средств при целом ряде эпителиальных видов рака. Нами показано усиление экспрессии данного тубулина в инвазивном крае опухоли у пациентов с колоректальным раком, что ставит вопрос о возможной роли этого изотипа тубулина в прогрессии и химиорезистентности данного вида рака.

Исследование было проведено на клеточных линиях КРР человека НТ-29 и НСТ116, в которых нами ранее была обнаружена экспрессия β_III-тубулина. Селективную транзиторную супрессию гена β_III-тубулина вызывали путем трансфекции в клетки β_III-tubbsiRNA, в качестве контроля выступала нецелевая siRNA, не имеющая гомологии ни к одному известному гену в последовательности ДНК человека (non-targetsiRNA). Степень подавления экспрессии β_III-тубулина на уровне белка оценивали в вестерн-блоттинге лизатов клеток, нормализованных по актину. Для оценки инвазивности клеток использовали инвазивные камеры, содержащие мембрану с диаметром пор 8,0 мкм, покрытую коллагеном, что имитирует инвазивное поведение клеток in vivo. Оценку жизнеспособности клеток проводили в МТТ-тесте, адгезивных свойств - по числу клеток, не адгезировавших к покрытому коллагеном пластику. Для анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла проводили окраску предварительно фиксированных в этаноле клеток с иодидом пропидия, для оценки апоптоза и некроза проводили окраску клеток с аннексином V и 7-амино-актиномицином-Д (7-AAD). Статистическая обработка проводилась с использованием теста Манна-Уитни либо парного теста Вилкоксона.

Чтобы оценить вклад β_III-тубулина, перспективного фактора прогноза при различных видах рака, в туморогенные свойства клеток КРР человека, мы провели эксперименты с транзиторным «выключением» данного изотипа тубулина в экспериментах с трансфекцией в клетки siRNA. Состояние РНК-интерференции привело к снижению содержания белка β_III-тубулина в 2,7 раза для HT-29 и в 1,7 раза для НСТ116. Угнетение экспрессии β_III-тубулина сопровождалось значительным изменением в плотности культур. Через 72 ч после трансфекции плотность культуры клеток НТ-29 составила 101,7±12,8% для нецелевой siRNA и 58,5±13,8% для β_III-tubbsiRNA (плотность контрольной интактной культуры была принята за 100%), для клеток HCT116 аналогичные показатели составили 85,0±21,7% и 34,8±16,6%. Для ответа на вопрос о жизнеспособности клеток с «выключенной» экспрессией β_III-тубулина клетки были окрашены на маркеры апоптоза и некроза. Как в клетках НТ-29, так и НСТ116, не было выявлено увеличения количества апоптотических либо некротизировавших клеток (не показано). Это свидетельствует о том, что уменьшение числа клеток в культуре после трансфекции происходит по иным механизмам. Мы также проанализировали распределение клеток линии НСТ116 с подавленной экспрессией β_III-тубулина по фазам клеточного цикла и не выявили различий с таковым для интактного контроля.

Возможным механизмом уменьшения плотности культуры клеток КРР с подавленной экспрессией β_III-tubb может быть снижение адгезивных свойств клеток и их открепление с пластиковой подложки в суспензию. Для проверки такой возможности мы изучили адгезивные свойства клеток после трансфекции siRNA в анализе с использованием покрытых коллагеном чашек Петри. Уровень адгезии снизился с 82,2 ± 4,2 до 67,2 ± 7,9% (р = 0,0436) для HCT116 и с 73,9 ± 2,5 до 36,1 ± 11,1% (р = 0,0044) для клеток НТ-29. Изучение инвазивной активности клеток в состоянии РНК-интерференции выявило значительное снижение их инвазивности - количество проникших в мембрану клеток уменьшилось в среднем (по данным трех независимых экспериментов) с 36,3 ± 23,3 до 9,9 ± 4,4 клетки в поле зрения для HT-29 (р < 0,05) и с 10,9 ± 10,0 до 2,7 ± 3,2 для HCT116 (р < 0,05). Возможным механизмом снижения инвазивности клеток в условиях сниженной экспрессии β_III-тубулина может быть подавление адгезии клеток к молекулам внеклеточного матрикса. Далее мы изучили воздействие на ростовые свойства клеток НСТ116 с «выключенным» β_III-тубулином 4 противоопухолевых лекарственных средств в МТТ-тесте. Полученные нами данные свидетельствуют, что угнетение экспрессии клетками колоректального рака β_III-тубулина не оказывало заметного влияния на устойчивость клеток к цисплатину (не показано), в то же время ИК₅₀ к винкристину увеличилась в 1,5 раза, что указывает на связь β_III-тубулина с механизмами чувствительности к данному винкаалкалоиду. При обработке клеток этопозидом наблюдалось статистически значимое увеличение (1,6 раза) устойчивости клеток с «выключенным» β_III-тубулином по сравнению с клетками, обработанными нецелевой siRNA. Значение ИК₅₀ для 5-фторурацила (5-ФУ) в клетках с подавленной экспрессией β_III-тубулина увеличилось почти в 10 раз по сравнению с контролем (нецелевая siRNA). 5-ФУ широко применим для лечения пациентов, страдающих колоректальным раком, и входит практически во все протоколы химиотерапии. Дальнейшее изучение механизмов воздействия β_III-тубулина на процессы химиорезистентности клеток КРР к 5-ФУ позволит найти эффективные способы преодоления устойчивости к терапии.

Представленные результаты свидетельствуют о важной роли β_III-тубулина в инвазивной активности клеток КРР с возможным механизмом реализации этого влияния посредством воздействия на систему адгезии клеток к молекулам внеклеточного матрикса. В условиях транзиторного отсутствия в клетках β_III-тубулина кратковременная устойчивость клеток к 5-ФУ, этопозиду и винкристину повышается, что может быть связано с нарушением многих процессов, влияющих на химиочувствительность, таких как биодоступность монослою клеток, внутриклеточный транспорт, биотрансформация в активные метаболиты и др. β_III-тубулин представляется перспективной молекулой, через блокаду экспрессии гена которой можно достигнуть снижения инвазивной активности опухолевых клеток КРР.