Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) относятся к числу наиболее распространенных и социально значимых заболеваний. Традиционные методы индикации респираторных вирусов имеют ряд недостатков, связанных с малой чувствительностью, большой длительностью, трудоемкостью и не всегда позволяют с высокой точностью выявлять в клинических образцах основные группы респираторных вирусов. В настоящее время для диагностики возбудителей ОРВИ предпочтение отдается полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Принципиальным преимуществом ПЦР-РВ является получение результатов диагностики в достаточно короткие сроки, упрощение анализа и снижение количества манипуляций с исследуемым образцом, и следовательно, уменьшение вероятности ошибок.

Цель- разработка, создание, апробация и внедрение в клиническую практику отечественных наборов реагентов для лабораторной диагностики ОРВИ методом ПЦР-РВ.

Для этапа выделения нуклеиновых кислот (НК) был оптимизирован протокол выделения нуклеиновых кислот колоночным методом. Данный протокол позволяет проводить одновременно выделение ДНК и РНК респираторных вирусов в одном исследовании. Степень чистоты выделенной ДНК/РНК по соотношению A260/A280 составляет не менее или равна 1,8-2,0. Для получения кДНК на матрице РНК использовали рекомбинантную обратную транскриптазу (ревертазу) (MMLV, «Fermentas», Литва). В качестве праймеров использовали случайные гексонуклеотиды (random) и смесь 4-х дНТФ, изготовленных ОДО «Праймтех» (Республика Беларусь). Приготовленную реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Полученную кДНК хранили при -20°С для последующих исследований.

Для каждого из респираторных вирусов были определены консервативные участки геномов. Подбор, разработку праймеров и зондов осуществляли с учетом состава оснований G/C, длины нуклеотидов в праймере и температуры плавления праймеров и зондов.

Для исключения ложноположительных результатов на этапе экстракции нуклеиновых кислот введен отрицательный контрольный образец (ОКО). В качестве положительного контроля этапа амплификации используется образец, содержащий генно-инженерную конструкцию на основе вектора pCR2.1, несущего участок гена-мишени соответствующих возбудителей ОРВИ человека.

В результате исследования разработаны наборы реагентов для проведения всех этапов ПЦР, а именно: набор реагентов для выделения ДНК/РНК с применением колонок с сорбирующей мембраной - «НуклеСорб», набор реагентов для постановки реакции обратной транскрипции РНК - «Ревертаза - М-MuLV-50», набор реагентов для выявления РНК респираторно-синцитиального вируса (hRSv), метапневмовируса (hMpv), риновируса (hRv), вируса парагриппа 1-4 типов (hPiv 1-4), ДНК аденовируса (hAdv) и бокавируса (hBov) в клиническом материале человека методом полимеразой цепной реакции в режиме реального времени - «ОРВИ-ген», набор реагентов для выявления РНК вируса гриппа человека типов А и В, субтипов А(Н1N1)pdm09, А(H3N2) методом ПЦР в режиме реального времени - «ФЛУ-ген».

Клинические испытания разработанных наборов показали, что аналитические характеристики соответствуют предъявляемым требованиям: специфичность разработанных реагентов составила 100%, аналитическая чувствительность - 1x10³ Гэ/мл. Отечественные наборы не уступают по качественным и количественным характеристикам зарубежным аналогам.