УДК: 616.61-036.22:578.7(047.3)(476), 578.4(047.3)(476)
Год издания: 2015

Разработка ПЦР тест-системы для диагностики BK вирусной инфекции

Дедюля К.Л.Амвросьева Т.В.Поклонская Н.В.Богуш З.Ф.Казинец О.Н.Землянский В.А.Лозюк С.К.
Рубрики: 34.25.3976.03.4176.29.36
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Разработать алгоритм лабораторной диагностики BK вирусной инфекции у пациентов с нефропатией и создать диагностическую тест-систему для выявления ее возбудителя» ГНТП ««Новые технологии диагностики, лечения и профилактики» (подпрограмма «Инфекции и микробиологические нанотехнологии»).
Сроки выполнения НИР: I кв. 2014 г. — IV кв. 2015 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. Т.В. Амвросьева.
Источник финансирования: госбюджет.

BK вирус по современной классификации входит в состав рода Polyomavirus (семейство Polyomaviridae). Он имеет выраженную тропность к эпителиальным клеткам почек и мочевыводящих путей и является одним из доминирующих вирусных патогенов, индуцирующих полиомавирус-ассоциированную нефропатию (ПВАН) у пациентов с иммунодефицитом различной этиологии (реципиентов органов и клеток, пациентов с ВИЧ, аутоиммунными или онкологическими заболеваниями). Клинически ПВАН достаточно сложно диагностировать, так как она мимикрирует отторжение трансплантата. Частота ее развития, как правило, в течение 1-го года после трансплантации составляет 1-10%. На поздних стадиях связанная с ПВАН потеря трансплантата может достигать 80%. Существенную роль в тактике ведения пациентов с BK вирусной инфекцией играет ее своевременная лабораторная диагностика и регулярный скрининг вирусной нагрузки. Данные исследования на постоянной основе осуществляются в большинстве цивилизованных стран. Что касается Республики Беларусь, то до недавнего времени научные работы по изучению данной инфекции не проводились. В связи с этим отечественная медицина испытывает определенные трудности в лабораторной диагностике BK вирусной инфекции, что связано с неразработанностью соответствующей методической и технологической базы. В рутинной практике диагностические исследования осуществляются эпизодически цитологическим методом - по обнаружению морфологически измененных «decoy» клеток в осадке мочи. Данный метод является морально устаревшим, имеет крайне низкую прогностическую ценность и в развитых странах, где лабораторная диагностика инфекции осуществляется с помощью количественной ПЦР, практически не используется.

Следует отметить, что зарубежные тест-системы для генодиагностических исследований BK вирусной инфекции имеют достаточно высокую стоимость, что делает их мало доступными для практического здравоохранения. В этих условиях создание отечественной количественной ПЦР тест-системы для диагностики данной инфекции и оценки уровня вирусной нагрузки у пациентов является сегодня актуальной задачей.

Исходя из вышеизложенного целью настоящего исследования была разработка диагностической тест-системы для выявления и количественного определения ДНК BК вируса в клиническом материале методом ПЦР в режиме «реального времени» с использованием белорусских реактивов и реагентов.

Разработку осуществили в несколько этапов, начиная с подбора праймеров, и заканчивая определением аналитических характеристик тест-системы.

Исходя из биологии BK вируса и анализа научной литературы по данной проблеме разработано 2 набора праймеров и зондов, локализованных в различных регионах его генома. Праймеры подобраны к наиболее консервативным участкам генома BK вируса и обозначены как BK-VP3 и BK-T, так как локализованы в участках генома, кодирующих капсидный белок VP3 и большой Т-антиген.

Выполнена оптимизация реакции ПЦР, которая включала два этапа: оптимизацию состава реакционной смеси (ПЦР-буфер, концентрация MgCl2) и подбор условий проведения реакции (температурный профиль и длительность каждого из сегментов цикла).

В качестве положительного контроля и количественного ДНК-стандарта для разработанной тест-системы на базе вектора pUC18 создана плазмида pBK-1,2VT, содержащая вставку размером 1228 пар оснований, кодирующая фрагменты-мишени для обоих наборов разработанных диагностических праймеров.

Концентрацию очищенного препарата плазмиды измеряли спектрофотометрически и определяли число молекул плазмиды. Из исходного препарата pBK-1,2VT готовили серию 10-кратных разведений с концентрацией ДНК от 1х106 до 1 ГЭ/мкл. Полученные разведения использовали в качестве матрицы в реакции с праймерами для изучения аналитической чувствительности тест-системы и приготовления ДНК-стандартов. Полученные результаты показали, что порог чувствительности набора в отношении BK вирусов был менее 10 копий/мкл. В качестве ДНК-стандартов выбраны две стандартные концентрации ДНК: 1х104 и 10 копий/мкл. Данные стандарты будут использованы как калибраторы при проведении количественной ПЦР для определения уровней ВК вирусной нагрузки в организме пациентов.

Изучение диагностической специфичности и чувствительности разработанной тест-системы проводили в параллельных исследованиях клинического материала - 46 проб клинического материала (24 пробы мочи и 22 пробы сыворотки крови), в которых ранее мультиплексной ПЦР с системой праймеров для выявления BK и JC вирусов было (в 8 пробах) или не было обнаружено (в 38 пробах) наличие ДНК BK и JC вирусов. При использовании созданной тест-системы BK вирус был выявлен во всех 8 положительных пробах. В установленных ранее 32 отрицательных пробах вирус не определялся.

Таким образом, разработанная тест-система для детекции ДНК BK вируса выявила все отобранные положительные и отрицательные пробы без ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что указывает на ее 100% диагностическую чувствительность и специфичность.

В ходе полевых испытаний тест-системы с использованием 466 образцов клинического материала, полученного в период с 2011 по 2014 гг. от реципиентов почки, выявлено 42 положительных пробы с уровнем вирусной нагрузки, варьировавшей от 4,2х107 до 1,3х104 копий/мл.

Созданная ПЦР тест-система для количественного выявления ВК вируса в клиническом материале не имеет аналогов в Беларуси и сопредельных странах-членах ЕАЭС, что указывает на хорошие перспективы ее востребованности на отечественном и зарубежном рынках диагностических средств. Актуальность данной разработки очевидна в связи с активным развитием трансплантации органов и тканей в последние годы. Кроме того, она может найти широкое использование для диагностики полиомавирусных осложнений при ряде заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями, с целью количественной оценки уровня ВК вирусной нагрузки и коррекции проводимой терапии (например, в онкологии, при обследовании пациентов со СПИД и др.).


Область применения: лабораторная диагностика вирусных инфекций, трансплантология, онкология.
Рекомендации по использованию: разработанная тест-система рекомендуется для использования в специализированных лабораториях учреждений здравоохранения республки, занимающихся диагностикой вирусных инфекций.
Предложения по сотрудничеству: консультативная и техническая помощь по лабораторной диагностике полиомавирусных инфекций, молекулярному типированию, дифференциации возбудителей и биоинформационному анализу полученных результатов.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта