УДК: 577.21.088.7:616.419-089.843(047.31)(476)
Год издания: 2015

Способ дифференциальной генодиагностики полиомавирусной инфекции у реципиентов гемопоэтических стволовых клеток

Амвросьева Т.В.Богуш З.Ф.Дедюля К.Л.Поклонская Н.В.
Рубрики: 34.25.3976.03.4176.29.46
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: Разработать и внедрить способ дифференциальной генодиагностики полиомавирусной инфекции у реципиентов гемопоэтических стволовых клеток».
Сроки выполнения НИР: январь 2014 г. — декабрь 2015 г.
Научный руководитель: Т.В. Амвросьева.
Источник финансирования: госбюджет.

Среди вирусных инфекций, приводящих к развитию тяжелых посттрансплантационных осложнений при пересадке органов и клеток, особого интереса заслуживает полиомавирусная инфекция (ПВИ) как менее изученная, но достаточно актуальная для иммунодефицитных пациентов, к которым относятся и реципиенты гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Среди 10 описанных в научной литературе возбудителей ПВИ наибольшую значимость имеют ВК и JC-вирусы, ассоциируемые с развитием геморрагического полиомавирусного цистита и прогрессивной мультифокальной лейкоэнцефалопатии. До начала настоящих исследований лабораторная диагностика ПВИ в нашей стране не осуществлялась, что было обусловлено отсутствием необходимой методической базы и недоступностью диагностических тест-систем западноевропейских производителей вследствие их чрезвычайно высокой стоимости.

Исходя из актуальных потребностей отечественного здравоохранения целью настоящего исследования явилась разработка способа дифференциальной генодиагностики ПВИ у реципиентов ГСК на предмет детекции ВК и JC-вирусов с последующей его апробацией в клинических условиях.

На первом этапе исследований для выявления данных возбудителей в клиническом материале (моча, сыворотка крови) была разработана оригинальная технология постановки ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов реакции в реальном времени. В ее основе лежит использование реакционной смеси, содержащей 10х буфер для Taq-полимеразы, 6 mM MgCl2, смесь дезоксинуклеотидов 200 мкмоль, 2,5 ед. Taq-полимеразы, по 15 pmol прямого (PM2+) и обратного (PM2-) праймеров, по 10 pmol гибридизационных зондов (BKVp-FAM и JCVp-ROX). В качестве положительного контроля для ПЦР-детекции ДНК BK-вируса использовали плазмиду pUC18/BK в концентрации 7,65х103 копий/мл, для ПЦР детекции ДНК JC-вируса - плазмиду pUC18/JC в концентрации 1х104 копий/мл, в качестве отрицательного контроля - ТЕ-буфер. Для реакции был выбран следующий температурный и временной профиль: 45 циклов денатурации (95°С в течение 15 с) и объединенной стадии отжига-элонгации (55°С в течение 40 с).

Созданная технология детекции ВК и JC-вирусов в клиническом материале далее легла в основу разработки способа (алгоритма) дифференциальной генодиагностики ПВИ у реципиентов ГСК в посттрансплантационном периоде, который включал 3 основных этапа обследования. Первый этап посвящен скрининговым исследованиям на предмет установления ВК и JC вирурии, так как репликация вирусов в моче свидетельствует об активации ПВИ. Положительный результат, полученный на этом этапе, позволяет предположить наличие у данного пациента риска развития ассоциированных с ПВИ осложнений. В случае выявления вирурии проводится следующий этап генодиагностики - ПЦР на наличие виремии (выявление ДНК полиомавирусов в сыворотке крови). Положительный результат на данном этапе указывает на необходимость определения вирусной нагрузки (3 этап генодиагностики) методом количественной ПЦР. При достижении вирусной нагрузки более 10 000 копий/мл рекомендуется коррекция применяемой схемы лечения (снижение доз иммуносупрессивных и/или включение в нее противовирусных средств). Коррекция терапии проводится под контролем количественной ПЦР для мониторинга уровня ВК/JC вирусной нагрузки.

Клинические испытания разработанного способа дифференциальной генодиагностики ВК и JC вирусной инфекции были проведены на ограниченном контингенте реципиентов ГСК (32 пациента в возрасте до 17 лет и 46 взрослых). Полученные результаты свидетельствовали о довольно частой регистрации ПВИ у данных пациентов. Так, среди детей ПВИ регистрировалась у 53,1% (17/32) обследованных и была представлена исключительно ВК вирусной инфекцией. При этом у 12 позитивных реципиентов имела место только ВК вирурия (37,5%), у 5 - ВК вирурия + ВК виремия (15,6%). Сроки первичной реактивации ПВИ у детей составляли 18,12±12,65 сут. Активная ПВИ регистрировалась у подавляющего большинства обследованных в первый месяц после трансплантации и достигала пика на 14-й день после операции (у 34,4%). Доля детей со значением ВК вирусной нагрузки в моче, имеющим предиктивную ценность (>107копий/мл), составила 12,5%, в сыворотке крови (>104копий/мл) - 3,1%.

Среди 46 взрослых реципиентов ГСК у 18 (39,1%) были выявлены маркеры ПВИ. При этом у 37,0% (17/46) регистрировалась ВК вирусная инфекция, у 8,7% (4/46) - JC вирусная инфекция. По результатам дифференциальной генодиагностики преобладала ВК вирурия, которая определялась у 28,3% (13/46) взрослых лиц. Одновременное выявление ВК и JC вирурии отмечалось у 2 пациентов (4,3%). Регистрировались также варианты: ВК вирурия + ВК виремия, ВК вирурия+ВК виремия+JC вирурия и JC вирурия (по одному человеку в каждой группе). Первичная реактивация ПВИ у взрослых выявлялась в среднем на 21,4±10,3 сут и достигала пика спустя 1 мес. после операции (у 17,4% обследованных). Доля ВК позитивных реципиентов с диагностически значимой вирусной нагрузкой в моче составила 8,7% (4/46). Все случаи зарегистрированной среди взрослых пациентов ВК виремии и JC вирурии имели подпороговые значения вирусной нагрузки.

Кинетика развития инфекционного процесса как у взрослых, так и у детей характеризовалась пиком нарастания к первому месяцу посттрансплантационного периода с последующим постепенным снижением в более поздние сроки наблюдения вплоть до 1 года.

Таким образом, разработанный способ дифференциальной генодиагностики ПВИ в процессе регламентируемого скринингового обследования пациентов позволяет достаточно эффективно выявлять активацию ВК и JC вирусов и осуществлять количественный мониторинг вирусной нагрузки, что имеет исключительно важное значение для выработки адекватных схем коррекции проводимой терапии с целью профилактики возможных посттрансплантационных осложнений.


Область применения: трансплантология, лабораторная диагностика вирусных инфекций.
Рекомендации по использованию: разработанный алгоритм вирусологического обследования пациентов при пересадке ГСК рекомендуется для использования в специализированных лабораториях научно-практических центров и учреждений здравоохранения республики.
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь по лабораторной диагностике вирусных инфекций при трансплантации органов и клеток.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта