По статистическим данным и нашим многолетним наблюдениям энтеровирусы (ЭВ) относятся к наиболее актуальным возбудителям инфекционных болезней в Республике Беларусь. Род Enterovirus включает значительное количество достаточно различающихся по генетическим и антигенным свойствам вирусов. Наиболее универсальным, чувствительным и специфичным методом детекции энтеровирусных агентов на сегодняшний день считается ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции в реальном времени. Несмотря на имеющуюся высокую востребованность данного метода в нашей стране при осуществлении массовых диагностических и санитарно-вирусологических исследований присутствующие на белорусском рынке импортные ПЦР тест-системы являются малодоступными для практического здравоохранения вследствие их значительной стоимости и сложности процедуры закупки.

Вышеизложенное явилось основанием для разработки технологии и создания отечественной ПЦР тест-системы с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени на основе использования реагентов и комплектующих белорусского производства в рамках осуществляемой инновационной деятельности, направленной на импортозамещение и валютосбережение.

На первом этапе исследований был разработан комплект праймеров и зондов для амплификации фрагмента кДНК ЭВ, а также кДНК внутреннего контрольного образца (ВКО). В результате анализа основных параметров с целью последующей экспериментальной оценки их свойств были выбраны и синтезированы 3 прямых праймера, 2 обратных праймера и 4 гибридизационных зонда для специфической диагностической ПЦР, а также 3 прямых, 3 обратных праймера и 7 зондов для амплификации внутреннего контрольного образца.

Далее были определены оптимальные условия реакции (94°С - 5 мин, 45 циклов, состоящих из денатурации 94°С в течение 15 с и отжига-элонгации при 60°С в течение 40 с) и оптимизирован состав реакционной смеси: 10 pmol праймеров, 5 pmol зонда на реакцию, буфер, содержащий 65 мМ Трис-HCl, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 7 мМ МgCl₂, 0,02% Твин 20, по 200 мкм дНТФ, 2,5 ед. Taq-полимеразы.

Дальнейшие исследования показали, что чувствительность 4-х разработанных комплектов праймеров и зондов составила 10³ ГЭ/мл ДНК pEV321-1056, что достаточно для их эффективного использования в ПЦР-анализе. Специфичность реакции составила 100%.

Для создания ВКО и положительного контрольного образца (ПКО) использовали технологию получения армированных РНК на основе пакующей системы РНК-содержащего фага MS2. Полученный по этой технологии контрольный образец устойчив к РНКазам, стабилен, неинфекционен для людей и проходит все те же стадии, что и исследуемые образцы.

На основе разработанной технологии создан экспериментальный образец тест-системы, включающий: ПЦР-смесь 1 (универсальная смесь, содержащая ПЦР-буфер для Taq-полимеразы, MgCl₂, и дНТФ); ПЦР-смесь 2 (специфическая ПЦР-смесь, включающая праймеры и зонды для детекции кДНК ЭВ и ВКО); раствор Taq-полимеразы; ПКО (армированная РНК, содержащая фрагмент-мишень для детекции ЭВ); отрицательный контрольный образец (ОКО) (буферный раствор, не содержащий ДНК); ВКО (армированная РНК, содержащая фрагмент-мишень для детекции ВКО). Общий объем реакции составляет 25 мкл. Разработанная тест-система предназначена для проведения 60 реакций, включая контроли, она адаптирована для использования на приборах роторного (Rotor Gene, Corbett) и планшетного (CFX, BioRad) типа.