Цель- разработать клеточный активатор на основе биологических агентов и изучить его активационные свойства на лейкоцитах крови в экспериментах in vitro.

Явление вторичного иммунодефицита на фоне возрастающей резистентности патогенных возбудителей к антибактериальным средствам является причиной роста числа хронических форм бактериальной инфекции, плохо поддающихся медикаментозному лечению. Для повышения иммунологической резистентности организма к инфекции принято использовать иммуностимулирующие средства, которые имеют ряд противопоказаний и побочных эффектов. Тем не менее, способы повышения безопасности иммуностимулирующей терапии отрицательно влияют на эффективность лекарственных средств (ЛС). Таким образом, особый практический интерес представляет собой экстракорпоральная иммуностимуляция (ЭИ) клеток крови. В ее основе лежит взаимодействие клеток крови с активатором вне организма с последующим их возвратом в организм пациента, где измененные (активированные) клетки крови реализуют свою функцию. Данный способ иммунокоррекции позволяет избежать развития побочных эффектов, связанных с введением в организм ЛС, сохраняя или увеличивая эффективность лечения.

Существует большое число активаторов клеток биологического происхождения. Однако использование этих иммуностимуляторов в качестве лиганда для экстракорпорального применения исключена из-за использования токсичных соединений в процессе получения ЛС. Лиганд-активатор для ЭИ должен обладать гидрофобными свойствами, иметь белковую составляющую для иммобилизации на матрицу и не подвергаться воздействию физико-химических факторов, способных влиять на конформацию активного центра лиганда.

В связи с этим лиганд был получен путем механического разрушения эукариотических клеток и очищен методом колоночной гель-хроматографии, что позволило сохранить химическую структуру веществ, входящих в состав полученной фракции, и избежать загрязнения раствора побочными продуктами распада и биологически активными веществами.

Биологические свойства фракции изучали в экспериментах in vitro на гепаринизированной донорской крови, смешанной в равных соотношениях с гипотоническим раствором NaCl (контроль), фракцией (проба) и суспензией цельных эукариотических клеток (группа сравнения).

Как видно из результатов, представленных в таблице 1, полученный активатор (фракция) способен индуцировать продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками. При этом в большей степени активирующее влияние проявляется в отношении синтеза ИЛ-6 и ФНО-α.

Таблица 1 - Цитокин-продуцирующая активность лейкоцитов в эксперименте

Цитокин	С физ. раствором	С фракцией-активатором	С суспензией эукариотических клеток
ИЛ-6, мкг/л	0,00 (0,00;0,6)	32,52* (19,49;43,33)	8,30* (2,71;20,54)
ФНО-α, мкг/л	13,49 (4,29;30,82)	291,04* (247,86;311,12)	345,1* (316,09;349,72)
ИЛ-1β, мкг/л	1,23 (0,34;4,77)	9,18 (3,27;17,95)	8,74 (7,4;12,89)
ИЛ-4, мкг/л	0,62 (0,2;2,4)	0,93 (0,78;1,37)	1,17 (0,62;1,96)

*р<0,05.

Значительное увеличение цитокин-продуцирующей функции лейкоцитов могло повлечь за собой спонтанную дегрануляцию нейтрофилов крови, однако уровень лейкоцитарной эластазы в пробах с активатором составил 0,15 (0,09; 0,39) мг/л, что сопоставимо со значениями в группе сравнения. Тогда как суспензия цельных клеток вызвала увеличение концентрации эластазы в крови,что составило 91,02 (33,99; 152,42) мг/л. Таким образом, фракция не активирует кислородный взрыв нейтрофилов, а значит, и ПОЛ (перекисное окисление липидов).

С помощью иммуноцитометрии определили, что фракция не обладает цитолитическим влиянием на клетки крови и не вызывает гибель лейкоцитов посредством апоптоза (СD95, аннексин V). Люминесцентное окрашивание образцов свидетельствовало об увеличении числа внутриклеточной РНК в нейтрофилах под действием фракции, что говорит об активации синтетической функции клетки.

В подтверждение активирующей способности фракции говорит тот факт, что ее инкубация с кровью привела к увеличению плотности экспрессии CD69 (рецептор ранней активации лейкоцитов) на мембране нейтрофилов до 39,9 (30,6; 45,9) % относительно 8,5 (8,1; 11,9) % в группе сравнения. Прослеживается неопределенное влияние фракции и на экспрессию толл-подобных рецепторов, ответственных за передачу внутриклеточного сигнала, однако в настоящий момент можно лишь говорить о тенденции к ее увеличению.

Таким образом, полученный клеточный активатор на основе эукариотических клеток показал себя как эффективный иммуностимулятор в отношении гранулоцитов крови. При этом характер его действия выгодно отличается от действия цельных клеток, так как не вызывает нежелательных эффектов (дегрануляция нейтрофилов, повышение уровня эластазы в плазме). Возможность иммобилизировать компоненты фракции на гемосовместимую матрицу позволит создать иммуномодулятор экстракорпорального типа, который найдет применение в клинической практике для коррекции различных иммунодефицитных состояний и терапии обусловленных ими заболеваний. За счет контактной специфической стимуляции клеток крови в экстракорпоральном контуре предложенный способ позволит оказывать направленное специфическое воздействие на клетки и даст возможность получить терапевтический эффект, превосходящий таковой пероральных иммуностимуляторов. И наконец, предложенный метод лишен побочных эффектов, связанных с введением и биотрансформацией ЛС.