При внедрении технологий клеточной трансплантации в экспериментальную и практическую медицину возникает вопрос: насколько эффективно прошла процедура трансплантации клеток, в каком количестве и локализации представлены клетки трансплантата и их потомки в тканях реципиента? Разработанные методики прижизненного мечения клеток липофильными красителями имеют определенные недостатки: токсичность для клеток, непродолжительность мечения, потеря специфического сигнала после нескольких клеточных делений. Альтернативой может служить оценка наличия генов мужского организма в тканях женского после разнополой клеточной трансплантации, особенно в экспериментальных работах на линейных лабораторных животных, когда нивелируется проблема реакции отторжения. Как и у большинства других млекопитающих, в геноме самцов крыс присутствует ген sry, локализованый в Y-хромосоме. Таким образом, определяя копийность гена sry, можно количественно оценивать присутствие клеток донора в тканях реципиента в различные сроки после трансплантации.

Цель- в эксперименте апробировать и адаптировать технологию отслеживания донорских мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в тканях реципиента по выявлению гена sry при разнополой родственной трансплантации.

МСК получали из костного мозга самцов белых крыс по стандартной методике протокола. В работу брали МСК третьего пассажа, которые в виде суспензии в концентрации 2х10⁶ кл/мл вводили самкам в системный кровоток через хвостовую вену. Через 45 сут после трансплантации животных выводили из эксперимента и выделяли внутренние органы. Отбирали фрагменты тканей печени, миокарда, селезенки, сальника и легкого для выделения ДНК. Геномную ДНК выделяли в соответствии с рекомендациями производителя набора K0512 (Fermentas, Литва).

Анализ ПЦР проводили при стандартных условиях на оборудовании Rotor Gene 3000 (Corbet). Использовали праймеры, специфичные для sry крысы. Для нормализации копийности гена применяли праймеры, специфичные для гена cyt p450c.

Копийность гена sry рассчитывали в процентах относительно представленности гена cyt p450c в проанализированных образцах ДНК. Для определения относительного уровня экспрессии гена значение эффективности амплификации возводили в степень -ΔCt для анализируемого гена и гена сравнения (для расчетов использовали значение эффективности ПЦР для гена сравнения 1,92). Эффективность ПЦР для выбранных пар праймеров составила 92-97%, что соответствует требованиям к постановке количественной ПЦР.

Было проанализированно более 100 образцов ДНК. Положительный результат ПЦР на последовательность гена sry был обнаружен у всех реципиентов в образцах тотальной ДНК двух и более органов. При этом позитивный результат выявили в тканях печени в 9, селезенки - в 14, сердца - в 11, легкого - в 10 и костного мозга - в 11 случаях из 14.

Рисунок 1 — Копийность гена Sry у самцов и самок

Было установлено, что копийность гена sry по отношению к гену cyt p450c в образцах ДНК тканей мужского организма составляет 397,6±36,96% (M±SE, N=14) (рисунок 1). Для этого параметра в образцах тканей женского организма с положительным результатом ПЦР было выявлено непараметрическое распределение признака (тест Шапиро-Вилкинсона, р<0,0001), и медианное значение составило 0,00049; 0,00024-0,00106 (Me; 25-75%) при среднем 0,0012±0,0003% (M±SE, N=54).

Рисунок 2 - Копийность гена Sry в тканях крыс самок

Медианное значение копийности гена sry для неверифицированных положительных случаев составило 0,00046; 0,00021-0,00097 (Me; 25%-75%, N=50), а для верифицированных - 0,00503±0,00193 (M±SE, N=4). При сравнении медианных значений копийности гена sry в этих группах были выявлены достоверные отличия р=0,001 (тест Манна-Уитней, U=12) (рисунок 2). Медианное значение копийности гена sry в неверифицированной группе соответствовало количеству трансплантированных клеток 1,07*10^-6, в верифицированной - 9,93*10^-6, или одна и десять донорских клеток на миллион клеток реципиента соответственно.

Применен и адаптирован метод определения генетического материала донорских клеток в тканях реципиента методом ПЦР. Установлено, что положительный результат ПЦР может быть получен для единичных клеток донора в образцах ткани, однако для получения надежного верифицированного результата необходимо, чтобы донорские клетки присутствовали в тканях в соотношении не менее 10^-5. Предложенный метод является значительно более чувствительным и менее трудоемким, чем гистологическое выявление. Экспериментально подтверждено выживание МСК донора в тканях реципиента в течение 45 сут после сингенной трансплантации.