Цель- адаптировать и внедрить в эксперименте современные флуоресцентные технологии отслеживания мезенхимальных стволовых клеток (МСК) донора в организме реципиента после трансплантации.

Исследованы лабораторные крысы (самцы) линии Wistar. Создана экспериментальная модель хронического токсического гепатита путем внутрибрюшинного введения 50% раствора CCl₄ (тетрахлорметан) на оливковом масле из расчета 1 мл на 1 кг массы тела 2 раза в неделю. Выделение и культивирование МСК из жировой ткани крыс проводили по стандартной методике протокола. Для экспериментов использовали МСК 2-3 пассажей. МСК типировали по характерной морфологии и экспрессии маркерных генов (CD 90, 29, 44, 45 и др.). МСК прижизненно окрашивали с помощью флуоресцентных красителей PKH 67 и CM-Dil по адаптированной в нашей лаборатории методике. Степень окрашивания МСК оценивали методом проточной цитометрии (прибор FC-500 «Beckman Coulter», США). Доля позитивно окрашенных клеток составила 97%. Для контраста дополнительно производили окраску ядер клеток пропидий йодидом (PI), дающим красное свечение. Для трансплантации лабораторным животным окрашенные МСК ресуспендировали в D-PBS и вводили в концентрации 1-3х10⁶ кл./мл на сайт введения на животное. Путь введения клеток: внутривенный системный (в хвостовую вену) и внутрипортальный. Животных выводили из эксперимента через 5 сут. Из печени крыс изготавливали криосрезы толщиной 8-10 мкм, высушивали и изучали на флуоресцентном микроскопе NIKON Eclipse E200.

При анализе изображений флуоресцентной микроскопии криосрезов печени крыс наблюдалась следующая картина (рисунок 1). Цитоплазма гепатоцитов люминесцирует зеленым цветом, ядра красные (мечены красителем PI). Определяются множественные флуоресцентные очаги желто-зеленого цвета (МСК, меченные PKH 67), располагающиеся вокруг портальных трактов, местами диффузно проникающие в дольки. Спустя 15-20 дней интенсивность специфической флуоресценции была резко уменьшена, вероятно, вследствие многократного деления МСК со снижением сигнала.

Рисунок 1 — Флуоресцентная микроскопия криопрепарата печени крысы с хроническим гепатитом на 5-е сут (объектив х10 (а), х40 (б))

При окрашивании МСК красителем CM-Dil в клетках индуцировалось свечение в красном спектре. Ядра были мечены красителем Dapi (контрастированы синим цветом) (рисунок 2).

Рисунок 2 - Состояние культур, меченных и немеченых МСК, после 3 сут совместного культивирования in vitro

(исходно 50% интактных клеток и 50%, меченных Dil-CM)

Флуоресцентная микроскопия криопрепаратов печени также показала наличие в перипортальных зонах очагов специфической флуоресценции (рисунок 3)

Рисунок 3 - Интегрирование меченных CM-Dil МСК в тканях организма (криосрез фрагмента печени; объектив х20): слева - инвертированная флуоресцентная микроскопия (черные вкрапления - меченные МСК)

Адаптированные и внедренные современные технологии прижизненной окраски МСК флуоресцентными липофильными красителями (PKH67, CM-Dil) показали высокую эффективность по отслеживанию донорских МСК в тканях реципиента. Методики с окрашиванием МСК наглядно демонстрируют инкорпорацию последних в ткани печени реципиента. Эти технологии особенно эффективны в ранние сроки после трансплантации (1-2 недели). Для трекинга донорских МСК требуется применение иных методик (генетических и др.).