В течение последних десятилетий активно разрабатываются методы клеточной терапии, в частности трансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), с целью замещения в организме поврежденных клеток и тканевых структур и восстановления функций различных органов.

МСК обладают рядом преимуществ для использования в качестве клеточного компонента в хрящевом биотрансплантате: доступность источника получения, высокий пролиферативный потенциал, пластичность дифференцировки клеток под действием индукторов, отсутствие иммуногенности, хоуминг МСК к месту повреждения. Одним из лимитирующих факторов клинического применения МСК является достаточность их количества для иммуномодулирующих (противовоспалительных) или заместительных (в составе биотрансплантата) целей. Для увеличения количества широко используют технологию их наращивания in vitro в присутствии ростовых факторов (РФ). В качестве источника РФ за последние 10-15 лет все шире используют растворимые факторы тромбоцитов (РФТ). При этом различие технологий получения РФТ позволяет получать лизат тромбоцитов (ЛТ) или релизат тромбоцитов (РТ), которые могут иметь различия не только в рост-стимулирующей активности, но и способности поддерживать направленную тканевую дифференцировку МСК.

Цель - изучить действие ЛТ и РТ на хондрогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и жировой ткани человека.

Сущность достижения и его новизна. Впервые изучено влияние растворимых факторов тромбоцитов, полученных разными методами, на хондрогенную дифференцировку МСК человека. Показано, что растворимые факторы тромбоцитов в условиях in vitro не способствуют дифференцировке в хондрогенном направлении МСК костного мозга и жировой ткани.

МСК получали из костного мозга и жировой ткани человека и культивировали in vitro. Образцы костного мозга и жировой ткани были предоставлены УЗ «9-я городская клиническая больница» г. Минска. Направленной дифференцировке в хондрогенном направлении подвергались МСК костного мозга и жировой ткани человека после двух пассажей культивирования in vitro. Дифференцировку выращенных МСК проводили в пеллетных условия культивирования в виде осадка клеток после мягкого центрифугирования. В полную хондрогенную бессывороточную среду, содержащую DMEM HG, ITS 100x, дексаметазон 100 нмоль, аскорбиновую кислоту 50 мкг/мл, L-пролин 40 мкг/мл, BSA 1,25 мг/мл, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10 нг/мл TGF-β3, помещали ЛТ или РТ тромбоцитов в конечной концентрации 2,5 и 5% (по объему). Культивирование проводили в течение 7 и 14 дней.

РТ получали путем активации тромбином отмытых тромбоцитов in vitro, ЛТ - путем замораживания (-80°С) - размораживания (+37°С) концентрата тромбоцитов. Препараты готовили по стандартным технологиям при концентрации тромбоцитов 5х10⁹/мл в отсутствии белков плазмы крови (в бессывороточной культуральной питательной среде α-MEM). Хондрогенную дифференцировку подтверждали молекулярно-генетическим методом (ОТ-ПЦР). Маркерами были выбраны гены ключевых компонентов внеклеточного матрикса суставного хряща (коллаген II типа (Сoll 2), аггрекан (ACAN) и Sox-9).

Показано, что эффективная хондрогенная дифференцировка в пеллетной культуре МСК костного мозга человека проходит в клетках, культивируемых в полной хондроиндукционной среде в присутствии TGF-β3, что подтверждено наиболее высокой экспрессией специфических молекулярно-генетических маркеров (Sox-9 и ACAN) (р<0,05). Добавление в дифференцировочную среду РФТ приводило к снижению экспрессии генов Coll 2, Sox-9 и ACAN до уровня недифференцированных клеток (р<0,05). Различия между 5% ЛТ и 5% РТ установлены только в отношении экспрессии гена ACAN: 5% РТ оказывал более сильное супрессивное влияние на экспрессию данного гена (р=0,009).

Результаты экспериментов свидетельствуют, что при проведении хондрогенной дифференцировки в пеллетной культуре МСК жировой ткани содержание в дифференцировочной среде РФТ также приводит к снижению экспрессии генов Coll 2, Sox-9 и ACAN по сравнению с дифференцированными клетками (р<0,05). Действие ЛТ и РТ на экспрессию маркерных генов различается. Достоверно более сильный супрессивный эффект на экспрессию генов Сoll 2, Sox-9 и ACAN в МСК на 7-е сут оказывает 2,5% ЛТ (р=0,049, р=0,034 и р=0,022 соответственно). Уровень экспрессии генов Сoll 2 и Sox-9 в МСК достоверно снижает присутствие 5% ЛТ на 7-е сут культивирования (р=0,002 и р=0,035). На 14-е сут наиболее сильный супрессивный эффект относительно экспрессии гена Coll 2 в МСК отмечается в присутствии 5% ЛТ (р=0,001). Однако при содержании в дифференцировочной среде 5% ЛТ уровень экспрессии гена Sox-9 на 14-е сут остается более высоким по сравнению с показателями клеток, культивируемых в присутствии 5% РТ (р=0,006).

Таким образом, эффективная хондрогенная дифференцировка в пеллетной культуре МСК как костного мозга, так и жировой ткани человека проходит в клетках, культивируемых в полной хондроиндукционной среде в присутствии TGF-β3 и при отсутствии растворимых факторов тромбоцитов.

Вид патентной защиты: отсутствует, планируется подача заявки.