Сегодня можно уверенно говорить о возможности дифференцировки стволовых клеток до эритроцитов in vitro, более того, возможна их трансфузия и доказана их конкурентоспособность с эритроцитами, созревшими in vivo (Fujimi A., 2008, Giarratana M., 2011). Остается нерешенным ряд проблем, влияющих на функциональную эффективность полученных клеток: недостаточная полнота дифференцировки до стадии эритроцита/ретикулоцита, низкий прирост клеточной массы, высокое содержание фетального гемоглобина в эритроцитах, полученных из стволовых клеток пуповинной крови.

Обоснованность внедрения в практику любого нового продукта определяется не только его востребованностью, но и стоимостью его производства. В нормальных условиях в организме здорового человека ежедневно образуется 2х10¹¹ эритроцитов. На образование дозы эритроцитов (2,5х10¹²) организму требуется 12-13 дней. Эритроциты формируются в компартментах костного мозга - эритроидных островках, что минимизирует межклеточные взаимодействия и позволяет производить большое число клеток в относительно небольшом объеме. Чтобы уменьшить ингибиторный эффект регуляторных факторов, выделяемых эритробластами при их созревании in vitro, клеточные взаимодействия ограничивают путем увеличения объема культуральной среды и поддержания клеток в концентрации менее 10⁶/мл. Поэтому производство одной дозы эритроцитной массы требует более 2500 л среды с ростовыми факторами. По данным американских коллег, расчетная стоимость производства дозы культивированных эритроцитов в таком случае составит до 15 тыс. долларов США, тогда как стоимость дозы донорских эритроцитов - 200-300 долларов США (Zeuner A., 2012).

Цель - изучить условия эффективной направленной эритроидной дифференцировки in vitro гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека и оценить возможность и экономическую целесообразность разработки и использования в трансфузиологии соответствующих технологий получения эритроцитов (ретикулоцитов).

Нами разработан метод трехстадийной эритроидной дифференцировки CD34-положительных клеток пуповинной крови in vitro с кратностью прироста 19070±3740 раз. Показано, что проведение сокультивирования эритроидных предшественников с мезенхимными стромальными клетками костного мозга на 7-17-й день эритродифференцировки приводит к дополнительному увеличению прироста эритроидных клеток в среднем в 5,3 раза в сравнении с воспроизведенным методом М. Giarratana (2011), а также превышает эффективность дифференцировки по методу E.J. Baek (2008), в 3-4 раза. Количество оксифильных нормобластов (стадия созревания, предшествующая стадии ретикулоцита) было 88%. Доля безъядерных клеток, среди которых могут содержаться как ретикулоциты, так и эритроциты, составляла 37%, содержание гемоглобина в среднем - 20 пг/кл. Разработан и утвержден лабораторный регламент эритроидной дифференцировки СD34- положительных клеток пуповинной крови in vitro.

Разработанная нами технология получения эритробластов при масштабировании процесса в лабораторных условиях позволит из CD34⁺ клеток одной единицы пуповинной крови получить 4х10¹⁰ эритроидных клеток терминальных стадий созревания. Для производства потребуется 27 л питательной среды, 1,4 л плазмы крови, ростовые факторы интерлейкин-3, эритропоэтин и фактор стволовых клеток, 420 культуральных флаконов. В этом случае затраты на приобретение сред и ростовых факторов составят более 20 тыс. долларов США.

В настоящее время во всем мире ведется поиск по удешевлению подобных технологий путем замены дорогостоящих компонентов питательной среды, таких как альбумин и трансферрин. Последний предлагается заменить хелаторами железа или железосодержащими соединениями. Кроме того, затраты поможет сократить повторное использование дорогостоящих компонентов. Цитокины потенциально могут быть заменены низкомолекулярными пептидами-миметиками. Подобные нововведения позволят сократить расходы на производство, но даже в этом случае стоимость одной питательной среды все равно останется больше стоимости трансфузионной единицы донорских эритроцитов.

Данная проблема требует радикального изменения подхода с использованием биореакторов. Биореактор позволяет контролировать кислотность, температуру, концентрацию кислорода - лимитирующие факторы, поддержание которых позволит минимизировать апоптотические процессы и существенно увеличить прирост клеток. При использовании реакторов на основе мембранных фильтров при должном удалении продуктов метаболизма клеток и снабжении их питательными веществами и кислородом концентрация клеток может быть увеличена до 2х10⁸/мл. Например, реактор с системой полых волокон вмещает 3000 м диализных мембран в объеме 100 мл.

Таким образом, на данном этапе целью технологии получения эритроцитов in vitro является не конкуренция с донорством, по крайней мере, в краткосрочной перспективе. Наиболее вероятные области применения - аллоиммунизированные пациенты, лица с редкими группами крови и гемоглобинопатиями - случаи, где материальные затраты сопоставимы, а в некоторых ситуациях превосходят стоимость дифференцировки in vitro. Ко всему прочему, клетки, полученные in vitro, должны функционировать в организме гораздо дольше, чем те, которые содержатся в дозе крови ввиду того, что обычная доза - это клетки с различным периодом жизни. Поэтому необходимый для трансфузии объем дифференцированной крови может быть меньше, что косвенно сократит ее стоимость. Полученная in vitro эритромасса может быть использована в случае необходимости трансфузии небольшого объема крови. В неонатологии используются трансфузии объемом 10-80 мл/кг веса ребенка, при этом известно, что переливание эритроцитов от взрослых доноров вызывает осложнения (бронхопульмонарная дисплазия и др.). Содержание фетального гемоглобина в дифференцированных in vitro эритроцитах пуповинной крови не является значимым фактором, так как у новорожденных детей количество фетального гемоглобина достигает 50-60%. Ряд исследований демонстрирует безопасность и эффективность трансфузии эритроцитов пуповинной крови новорожденным (Baer V.L., 2011, Zhurova M., 2012, Rashid N., 2013).

Вид патентной защиты: отсутствует, планируется подача заявки.