УДК: 57.085.23:[576.5+616:612.017.1]
Год издания: 2016

Метод получения биомедицинского клеточного продукта на основе мезенхимальных стволовых клеток обонятельной выстилки носовой полости

Гончаров А.Е.Антоневич Н.Г.
Рубрики: 34.19.2176.03.55
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: Разработать и внедрить метод лечения хронических стенозов трахеи и гортани с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из обонятельной выстилки слизистой оболочки носовой полости.
Сроки выполнения НИР: июль 2016 г. — июль 2019 г.
Научный руководитель: канд. мед. наук А.Е. Гончаров.
Источник финансирования: госбюджет.

В настоящий момент активно изучаются иммунофункциональные свойства мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из различных тканевых источников, и оценивается эффективность биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) на их основе в сочетанном лечении заболеваний системы иммунитета. Актуальной задачей является оптимизация метода получения первичных культур и накопления в пассажах биомассы жизнеспособных высокопролиферативных МСК обонятельной выстилки (ОВ) для производства БМКП.

Цель исследования - разработать метод получения биомедицинского клеточного продукта на основе МСК ОВ носовой полости и дать характеристику иммунофункциональным свойствам полученных клеток.

Для определения оптимального способа получения первичных культур проведено сравнение методов механической (метод эксплантов) и ферментативной диссоциации (0,25% раствор трипсина; последовательная обработка 0,5% раствором диспазы I и 0,5% раствором коллагеназы Н) ткани ОВ. Наилучший результат получен при использовании метода эксплантов (культуры получены в 90±6,7% экспериментов), который обеспечивает сохранение жизнеспособных клеток в толще ткани, адгезию к культуральному пластику, последующую миграцию и пролиферацию клеток, в то время как обработка ткани ферментами снижает жизнеспособность клеток и уровень адгезии по сравнению с методом эксплантов (p<0,05).

В результате морфологического анализа первичных культур ОВ выявлены два основных типа клеток: эпителие- и фибробластоподобные клетки. Пассирование гетерогенной первичной культуры на 1-2 пассаже приводит к селекции по пролиферативной активности популяции фибробластоподобных МСК ОВ, которые характеризуются иммунофенотипом CD90+CD105+CD73+CD45-CD31-EpCAM-, дифференцировочным потенциалом в хондро-, адипо-, остео-, нейрогенном направлениях.

С целью обогащения культур МСК ОВ клетками с выраженными мультипотентными свойствами оценивали способность к сферообразованию в монослойных культурах. Для этого использовали сфероиндуцирующую среду DMEM/F12 с добавлением АВ0-сыворотки человека, инсулина, Na2SeO3, апо-трансферрина, EGF и FGF-2. В данных условиях в культурах пролиферативноактивные МСК ОВ формируют клоны, которые растут в суспензии в виде конгломератов - сфер. Экспрессия нестина - маркера стволовых клеток, у сферообразующих клеток была в 2,3 раза выше, чем у клеток контрольных культур (р = 0,025). На 8-м пассаже проводили сравнение пролиферативной активности контрольных культур и обогащенных на ранних пассажах сферообразующими клетками. Индекс пролиферации контрольных культур составил 4,1 (3,8-4,5) усл. ед. и был достоверно ниже данного показателя культур, полученных из сфер, который составил 5,8 (5,3-6,2) усл. ед., р = 0,03 (учет результатов на 5-е сут роста культур, начальная плотность посева - 10 тыс. кл./см2).

Для оптимизации получения БМКП на конечном этапе производства сравнивали влияниея условий хранения на жизнеспособность МСК ОВ. Жизнеспособность клеток в свежеприготовленной суспензии составила 93,3±0,5%. После хранения суспензии (5-10 млн кл./мл) в течение 6 ч при +4°С жизнеспособность клеток составила:1) физиологический раствор 0,9% NaCl - 85,4±2,4 %; 2) физиологический раствор 0,9% NaCl с добавлением 1% раствора аминокислот Инфезол-40 - 84,6±3,5%; 3) 10% раствор альбумина (РПНЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий) - 94,4±0,2%. Таким образом, раствор альбумина выбран для использования на конечном этапе производства БМПК. В полученных БМКП не выявлено контаминации аэробными и анаэробными бактериями, грибами, герпесвирусами (ВПГ 1 и 2 типов, ЦМВ, ВЭБ, ВГ-6), микоплазмами.

Одним из этапов оценки потенциала МСК ОВ к регуляции интенсивности и направленности иммунного ответа явился иммунофенотипический анализ клеток. Установлено, что МСК ОВ экспрессируют адгезивные (CD11b, CD34, CD49f, CD54, CD90, CD106, CD146), костимуляторные (CD40), коингибиторные (CD273, CD274, CD276, B7-H4) молекулы, ферменты (эктонуклеотидазы CD39, CD73), характеризуются высокой продукцией активных форм кислорода при отсутствии продукции провоспалительных (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α) и регуляторных (ИЛ-10, ИЛ-12) цитокинов.

Показано, что МСК ОВ подавляют ФГА-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов периферической крови при контактном сокультивировании in vitro на 65% (p = 0,027), причем необходимым условием проявления иммуносупрессии является непосредственный контакт клеток. При этом в популяции МСК ОВ возрастает число CD54+ клеток в 1,6 раза (p=0,002) и уровень экспрессии этой адгезивной молекулы в 25 раз (р = 0,002); снижается количество CD106+ клеток в 7,8 раз (р = 0,018) и экспрессия - в 4,9 раза (p = 0,006), возрастает число клеток, экспрессирующих коингибиторную молекулу CD274 в 24,5 раз (p = 0,002). В свою очередь, в общей фракции МПК снижается содержание CD3+Tim3+ Т-клеток с 79,8 (76,6-82,7)% (контроль) до 54,8 (52,5-55,1)% (р = 0,009), CD3+CD279+ Т-клеток c 84,2 (81,0-89,4)% (контроль) до 50,2 (49,1-55,6)% (р = 0,009) и CD3+CD28+ Т-клеток с 89,6 (88,3-90,1)% (контроль) до 70,1 (69,2-73,4)% (р = 0,012), снижается число клеток, продуцирующих интерферон-ϒ с 43,8 (34,7-49,7) до 27,5 (24,5-34,5)% (р = 0,015) и ИЛ-2 с 26,5(20,5-28,6) до 13,5(12,3-15,4)% (р = 0,015). Также показано, что совместное культивирование с МСК ОВ значимо не влияет на продукцию CD3+ Т-лимфоцитами ИЛ-13, ИЛ-17 и ИЛ-5 (р>0,05).

Таким образом, разработан протокол накопления биомассы МСК ОВ, который предполагает получение первичных культур методом эксплантов, использование на ранних пассажах сфероиндуцирующей среды DMEM/F12 с добавлением инсулина, селенита натрия, апо-трансферрина, EGF и FGF-2 для селекции сферообразующих клеток. Показано, что полученные МСК ОВ обладают выраженными иммуносупрессивными свойствами в отношении Т-клеток in vitro.


Область применения: иммунология, клеточные биотехнологии, трансплантация клеток.
Рекомендации по использованию: внедрение метода получения биомедицинского клеточного продукта на основе МСК ОВ носовой полости в практику организаций здравоохранения и в учебную практику высших учреждений образования Республики Беларусь.
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь при внедрении, обучение на рабочем месте.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2022 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта