Цель - разработка диагностической платформы оценки возрастных изменений (биологического возраста) c использованием молекулярно-генетических маркеров. Создание набора праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с описанием условий их амплификации, при помощи которых будет реализовываться алгоритм сравнения анализируемых групп генетических маркеров.

В исследовании были задействованы пациенты следующих учреждений: «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека», «Гомельская городская клиническая больница скорой медицинской помощи» и «Гомельский областной клинический госпиталь инвалидов Отечественной войны». Научно-исследовательская работа проводилась на базе научно-исследовательской лаборатории УО «Гомельский государственный медицинский университет». Общее число пациентов - 81 человек (средний возраст 49,2±19,6 года) - было разделено на 3 возрастные группы (по 27 человек): 21-40 лет, 41-60 лет и 61-80 лет.

Материалом выделения ДНК для определения количества митохондриальной ДНК (мтДНК) являлась цельная кровь пациентов.

Для определения количества мтДНК во всех образцах выявляли фрагмент гена мтДНК ND1 (NАDН-дегидрогеназа) и фрагмент гена ядерной ДНК (яДНК) RPPH1 (Ribonuclease P RNA Component H1) с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) по протоколу TaqMan.

Для получения стандартизированных результатов ПЦР использовали готовые коммерческие наборы: 2хПЦР-буфер Maxima Probe qPCR Master Mix («Thermo Scientific», США), праймеры синтезировали в компании «Праймтех» (Беларусь).

Для количественного расчета мтДНК и яДНК необходимы стандарты с известным числом копий молекул ДНК. В качестве стандарта необходимо использовать очищенные ампликоны исследуемых участков генов мтДНК (mtND1) и яДНК (RPPH1). Для очистки ампликонов с целью получения стандартов предпочтительны коммерческие наборы, основанные на магнитной сепарации, или их аналоги. После очистки с помощью фотометра определяют концентрацию (нг/мкл) и производят расчет числа копий молекул в полученных препаратах. Расчет выполнен с помощью программ конверсии концентрации в число молекул, широко представленных в свободном доступе на электронных ресурсах.

Нами апробирован метод, основанный на расчете отношения числа копий локусов митохондриальной ДНК (mtND1) к ядерной ДНК (RPPH1) с применением стандартов, который может быть использован для количественного анализа мтДНК как генетического маркера возраст-ассоциированных изменений.

Различие средних величин отношения мтДНК/яДНК возрастных групп статистически значимо на уровне р<0,05, сила влияния фактора возраста - 46%. Референтный диапазон величин отношения мтДНК/яДНК в возрастной группе 21-40 лет составляет 206,13-277,27; 41-60 лет - 105,78-161,06 и 61-80 лет - 84,46-107,79.