Цель работы - разработка методологии одновременной быстрой диагностики внелегочного туберкулеза и лекарственной чувствительности возбудителя на основе молекулярно-генетических и бактериологических исследований нереспираторных образцов и резекционного материала.

Неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по внелегочному туберкулезу и увеличение количества случаев заболевания с признаками множественной лекарственной устойчивости требует разработки и внедрения современных методов для более быстрой и ранней диагностики туберкулеза. Существующие лабораторные методы детекции микобакторный туберкулез (МБТ), основанные на прямом или косвенном выявлении возбудителя, весьма эффективны, но либо недостаточно чувствительны, либо характеризуются длительностью получения ответа. Все вышесказанное подчеркивает необходимость использования новых более совершенных методов обнаружения МБТ сочетающих высокую специфичность и быстроту детекции. В этом отношении одним из наиболее перспективных направлений в развитии методов прямой детекции МБТ является использование технологий, основанных на обнаружении ДНК микобактерий туберкулеза.

Проведено хирургическое лечение 10 пациентов с внелегочным туберкулезом, получены нереспираторные образцы и тканевой материал для выделения ДНК микобактерий туберкулеза, оптимизирована методика ее выделения из нереспираторных образцов и тканевого материала различных органов для молекулярно-генетических исследований.

Среди 10 пациентов было 6 (60%) женщин и 4 (40%) мужчин. Средний возраст пациентов составил 37,3 года. Впервые выявленные пациенты - 9 (90%), ранее находился на лечении 1 (10%) (лечение после неудачи).

Доля впервые выявленных лиц с внелегочным туберкулезом в среднем составила 90%.

По клиническим диагнозам при поступлении пациенты распределились следующим образом: 7 (70%) - фибринозно-экссудативный плеврит неясной этиологии; 1 (10%) - спондилит грудного отдела позвоночника неуточненной этиологии; 1 (10%) - подозрение туберкулеза почки; 1 (10%) - остит тела грудины, осложненный натечным абсцессом.

Семи пациентам с плевритом выполнена видеоассистированная торакоскопия с санацией плевральной полости и биопсией плевры; 1 случай (подозрение туберкулеза почки) - выполнена резекция мочеполовых органов: нефрэктомия с резекцией надпочечника; 1 случай (спондилит) - секвестрнекрэктомия Th6-Th7, спондилодез с трансплантацией фрагментов костной ткани с кортикальным слоем, иссечение свищевого хода; 1 случай (остит грудины)т - удаление капсулы абсцесса.

Материал, полученный во время операций, был отправлен на гистологическое и бактериологическое исследование.

Тест Xpert MTB/RIF проводился на оборудовании GeneXpert от компании Cepheid (Саннивейл, штат Калифорния). Этот двухступенчатый процесс включал в себя обработку клинических образцов и полимеразную цепную реакцию. Образцы лизировались, ДНК изолировалась и амплифицировалась, затем ампликон идентифицировался. Семигнездовая полимеразная цепная реакция в режиме реального времени амплифицировала специфическую последовательность гена rpoB, которая затем тестировалась молекулярными маяками (molecular beacons) на мутации в районе устойчивости к рифампицину.

Перед хирургическим лечением всем пациентам было выполнено бактериоскопическое и бактериологическое исследование нереспираторных образцов (плевральной жидкости, мочи и содержимого абсцесса).

В плевральной жидкости у всех 7 пациентов отмечались отрицательные результаты как бактериоскопические так и бактериологические перед операцией. Используя экссудат для выявления МБТ методом ПЦР при дифференциальной диагностике плевритов, было установлено, что только у 1 (10%) пациента с подтвержденным диагнозом туберкулезного плеврита ДНК МБТ была обнаружена в экссудате. Такой результат недостаточен для верификации туберкулезного плеврита, что, вероятно, связано с тем, что у большинства пациентов с этой формой туберкулеза МБТ в экссудате не выявляются никаким из известных лабораторно-диагностических методов, и даже для такого чувствительного метода, как ПЦР, количество МБТ недостаточно. Это делает, с нашей точки зрения, мало эффективным применение метода ПЦР в исследовании плевральной жидкости для диагностики плевритов.

При трехкратном бактериоскопическом и бактериологическом исследовании мочи у пациента с туберкулезом почек также получены отрицательные результаты бактериологического анализа, в т.ч. Xpert MTB/RIF.

При исследовании содержимого абсцесса как при БЦЖ-остите, так и спондилите обнаружены ДНК микобактерий, RIF-чувствительные.

У всех 10 пациентов туберкулез был подтвержден морфологически. По клиническим диагнозам после операции отмечено следующее распределение: 7 (70%) - фибринозно-экссудативный плеврит туберкулезной этиологии; 1 (10%) - спондилодисцит грудного отдела позвоночника туберкулезной этиологии; 1 (10%) - поликавернозный туберкулез почки и мочеточника с отсутствием функции; 1 (10%) - БЦЖ-остит тела грудины, осложненный натечным абсцессом.

При молекулярно-генетическом исследовании резекционного материала получены положительные результаты теста Xpert MTB/RIF во всех 10 случаях, при этом у 8 пациентов установлена RIF-чувствительность, а у 2 с туберкулезным плевритом - RIF-устойчивость.

В результате исследования было установлено, что молекулярно-генетический метод GeneXpert MTB/RIF является эффективным и быстрым для диагностики внелегочного туберкулеза. Метод позволяет быстро, за 2 ч, выявить ДНК МБТ в биологическом (резекционном) материале, а также установить наличие лекарственной устойчивости микобактерии к рифампицину. Однако метод недостаточно эффективен при исследовании нереспираторных образцов (моча, плевральная жидкость). Для качественной диагностики и обеспечения достоверности результатов тест-системы GeneXpert MTB/RIF необходимо правильно собрать диагностический материал.

Нами была оптимизирована методика выделения ДНК микобактерий туберкулеза из нереспираторных образцов и тканевого материала различных органов. При работе с резекционными (тканевыми) образцами необходимы дополнительные методы обработки биологического материала (разжижение и деконтаминация, многократная отмывка от примесей крови).