В последние десятилетия участились случаи преодоления межвидового барьера вирусами животных, сопровождающиеся развитием тяжелых респираторных заболеваний у людей. Высоко патогенный вирус гриппа птиц А(Н5N1) регулярно вызывает заболевания людей в природных очагах. Периодически поступают сообщения о тяжелых респираторных инфекциях, вызванных другими субтипами вирусов гриппа птиц, такими как А(H7N9) и A(H9N2). Помимо вирусов гриппа способностью преодолевать межвидовой барьер обладают и коронавирусы. С 2012 г. регулярно появляются сообщения о тяжелых респираторных инфекциях, в т. ч. с летальным исходом, вызванных новым коронавирусом MERS-CoV.

Существенную роль в обеспечении биобезопасности страны, организации адекватных профилактических мероприятий и соответствующего клинического ведения пациентов играет своевременное выявление этих возбудителей современными методами лабораторной диагностики, позволяющими в короткий срок выявить этиологический агент инфекции. К таким методам относится полимеразная цепная реакция (ПЦР). Разработка отечественного набора для выявления новых для человека респираторных вирусов гриппа А, субтипов Н5, Н7, Н9 и нового респираторного коронавируса MERS-CoV имеет не только большую социально-экономическую значимость, но и представляет значительный интерес как для практического здравоохранения, так и научных исследований.

Цель исследования - разработка, создание, апробация и внедрение в клиническую практику отечественного набора реагентов для выявления методом ПЦР возбудителей тяжелых острых респираторных инфекций, ассоциированных с новыми для человека вирусами.

В ходе разработки набора были определены консервативные участки соответствующих генов для каждого из искомых возбудителей, к которым на основании анализа нуклеотидных последовательностей, представленных в Международном генетическом банке данных (GenBank), подбирали праймеры и зонды. Праймеры и зонды для детекции вируса гриппа подбирали к консервативному участку соответствующего субтипа гена гемагглютинина (HА). В качестве мишени для детекции коронавируса MERS-CoV использовали верхнюю область гена Е-протеина (upE)1 и открытую рамку считывания гена 1а (ORF 1a). Праймеры и зонды анализировали на наличие вторичной структуры, содержание G/C, возможность образования димеров, шпилек и неспецифической гомологии. Олигонуклеотидные зонды моделировали с 5^’конца нуклеотидной последовательности флуорами, которые позволяют регистрировать флуоресценцию по нескольким каналам одновременно (FAM, HEX, ROX) в мультиплексном формате ПЦР, с 3^’конца размещали гаситель флуоресценции.

В результате проделанной работы разработан набор реагентов «ТОРИ-ген» для выявления методом ПЦР возбудителей тяжелых острых респираторных инфекций, ассоциированных с новыми для человека вирусами. В основе набора лежит принцип процесса амплификации ДНК методом ПЦР, в ходе которой повторяются циклы денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей Taq-полимеразой. В наборе предусмотрен способ детекции продуктов амплификации в режиме реального времени («Real time»). Для контроля этапов выделения нуклеиновых кислот и реакции амплификации в наборе предусмотрен эндогенный внутренний контроль (ген «домашнего хозяйства человека»). Комплект положительных контрольных образцов разработан на основе плазмидных конструкций. Оценка аналитической специфичности разработанного набора с использованием положительных контрольных образцов показала специфичность созданных праймеров и отсутствие перекрестных реакций и достигла 100%. Аналитическая чувствительность набора составила 1x10³ Гэ/мл для всех типов плазмид. Таким образом, разработанный отечественный набор не уступает по качественным и количественным характеристикам зарубежным аналогам.