Острые кишечные инфекции (ОКИ) являются одной из значимых социально-экономических проблем во всем мире. Зачастую из-за схожести клинического течения данной этиологически разнородной группы заболеваний только специфическая лабораторная диагностика (СЛД) позволяет установить их этиологическую природу и на этой основе провести адекватные профилактические, лечебные и противоэпидемические мероприятия. Наиболее распространенным методом СЛД ОКИ вирусной этиологии является иммуноферментный анализ (ИФА), однако в отличие от некоторых других современных методов исследования (полимеразная цепная реакция, иммунный блоттинг) антигены каждого возбудителя выявляются в отдельных реакциях и фактически с помощью отдельных диагностических наборов.

Цель исследования - разработка комбинированной тест-системы для одновременного (в одной лунке) определения антигенов рота-, адено- и коронавирусов методом иммуноферментного анализа с подтверждающим тестом и организация ее производства.

Задачами проекта являлись:

· разработка принципиальной конструкции, состава и способа применения тест-системы;

· оптимизация способов получения иммунобиологических компонентов (антигенов, иммуноглобулинов, конъюгатов) и оценка их качества;

· разработка нормативно-технической документации (НТД): технологического регламента производства, технических условий (ТУ), инструкции по применению, а также программы и методики медицинских испытаний;

· государственная регистрация и организация производства нового диагностического набора.

В результате исследований разработана оригинальная принципиальная конструкция тест-системы для одновременного выявления в одной лунке антигенов рота-, адено-, коронавирусов методом ИФА с подтверждающим тестом (ИФА-РОТА-АДЕНО-КОРОНА-АГ-Конф). Принцип действия тест-системы состоит в следующем. Исследование включает 2 этапа. На первом этапе происходит индикация антигенов указанных выше вирусов в любом сочетании. На втором этапе осуществляется этиологическая идентификация антигенов и одновременно подтверждение специфичности результатов исследования.

Содержащийся в пробе антиген образует иммунный комплекс с иммобилизированными в лунках планшета специфическими антителами (пул антител к рота-, корона-, аденовирусам); добавление к образовавшемуся иммунному комплексу антивирусного конъюгата (специфические иммуноглобулины к антигенам всех определяемых вирусов, конъюгированные с пероксидазой хрена) обеспечивает специфическое связывание конъюгата с вирусными антигенами в случае их наличия в исследуемой пробе; при добавлении субстрат-индикаторного раствора комплекс приобретает окрашивание, степень которого определяется спектрофотометрически и прямо зависит от количества вирусных антигенов в пробе. Таким образом, на первом этапе исследования выявляется наличие хотя бы одного или нескольких антигенов определяемых вирусов (в случае окрашивания реакционной смеси в лунке) или их отсутствие в пробе.

На втором этапе в положительную по результатам первого этапа исследования, т.е. содержащую в любом сочетании антигены рота-, корона-, аденовирусов пробу, добавляют соответствующий конфирматорный реагент (КфР-рота, КфР-корона, КфР-адено) в специально подобранной концентрации, что приводит к иммуноспецифической нейтрализации антигенов соответствующих вирусов и проявляется в снижении степени окрашивания реакционной смеси в лунке в 2 раза и более по сравнению с контрольным реагентом, который не блокирует антигены определяемых вирусов.

Тест-система состоит из 12 компонентов, в т.ч. 5 иммунобиологических (ИК), и рассчитана на 96 исследований. ИК изготавливаются на основе нативных культуральных вирусных антигенов и иммуноглобулинов к ним производства РНПЦ эпидемиологии и микробиологии. Конъюгат получали путем химического соединения смеси противорота-, противокорона- и противоаденовирусного иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (RZ>2,8) по методу B. Wilson et P. Nacane. Оптимальные разведения ИК подбирали методом ИФА путем шахматного титрования.

Диагностическая эффективность тест-системы определялась в предварительных исследованиях и предрегистрационных испытаниях на 3-х клинических базах с использованием панелей заведомо положительных и отрицательных образцов. По результатам испытаний чувствительность и специфичность тест-системы составили 100%.

Разработан комплект НТД, осуществлена государственная регистрация нового диагностического набора «Тест-система комбинированная для одновременного определения антигенов рота-, адено- и коронавирусов методом иммуноферментного анализа по ТУ BY 100558032.359-2017, регистрационное удостоверение № ИМ-7.105641. Организовано его производство в РНПЦ эпидемиологии и микробиологии.

Определяется патентоспособность разработки. Заявленный технологический подход может использоваться как прототип для одновременного выявления других возбудителей. Наиболее эффективным применение подобных наборов ожидается при скрининговых исследованиях и сочетанных ОКИ.