HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В (ВГВ) - является ранним и наиболее значимым лабораторным маркером вирусного гепатита В. Объем регламентированных массовых исследований по выявлению HBsAg методом иммуноферментного анализа (ИФА) в Республике Беларусь достигает 1 млн в год. Эффективность этих исследований зависит от качества диагностических наборов, уровня их специфичности и чувствительности. В Беларуси функционирует система контроля качества регистрируемых наборов, входного контроля закупаемых серий, меж- и внутрилабораторного контроля. Существенным недостатком этой системы является отсутствие сертифицированного стандарта HBsAg, позволяющего оценить качество используемых тест-систем по количеству определяемого маркера (чувствительности). Отсутствие такого сертифицированного стандарта в республике на практике приводит к использованию т.н. панелей образцов, поставляемых производителями наборов или разработанных и изготовленных с их участием. Нередко ни предлагаемые панели образцов, ни сами диагностические наборы не соответствовали декларируемым параметрам качества. Массовое же использование некачественных тест-систем неизбежно приводит к снижению эффективности ранней диагностики вирусного гепатита В, в т. ч. у доноров крови, и существенному социально-экономическому ущербу для страны. Повышению качества, стандартизации исследований по выявлению HBsAg в мире придается большое значение. С этой целью разработаны международный (МС) и национальные государственные стандарты этого маркера ВГВ. Это обусловливает и необходимость разработки, сертификации и внедрения государственного стандартного образца (ГСО) HBsAg в нашей республике. Прототипами такого стандарта являются МС HBsAg, британский национальный стандарт HBsAg, отраслевой стандарт РФ, соответствующий китайский национальный стандарт и др.

Действующий в настоящее время третий МС HBsAg может быть использован в качестве калибровочного референс-образца концентрации HBsAg при разработке ГСО HBsAg. При этом необходимо учитывать молекулярно-биологическую характеристику циркулирующей на территории Беларуси популяции вируса, а также неодинаковую способность ИФА-тест-систем выявлять HBsAg различных генотипов ВГВ.

Новизна разработки заключается в том, что ГСО HBsAg на основе третьего международного стандарта HBsAg в Республике Беларусь создается впервые. При этом заменить ее аналогичной импортной продукцией не представляется возможным из-за специфического статуса национального государственного стандарта.

Методология разработки, сертификации и производства ГСО определялась на основании положений ТКП 8.005-2012 «Стандартные образцы. Основные положения. Порядок разработки, утверждения, регистрации и применения»; СТБ ISO Guide 34-2012 «Общие требования к компетентности изготовителей стандартных образцов»; СТБ ИСО Руководство 35-2007 «Стандартные образцы. Общие и статистические принципы сертификации» и др. Учитывались данные литературы о зарубежных аналогах. В результате анализа информации и консультаций с БелГИМ определена методология разработки, сертификации и производства ГСО HBsAg, разработано и согласовано БелГИМ «Техническое задание на разработку Государственного стандартного образца состава поверхностного антигена вируса гепатита В».

Сертифицируемым параметром ГСО является концентрация (специфическая активность) HBsAg, при этом определяются погрешность измерения величин сертифицируемого параметра, а также показатели однородности и стабильности ГСО как единицы измерения этого маркера ВГВ при исследованиях методом ИФА.

ГСО HBs-антигена представляет собой сыворотку или плазму крови человека сухую, лиофилизированную, инактивированную нагреванием, объемом 1,0 мл во флаконе (масса сухого вещества во флаконе 0,05±0,01 г), с концентрацией HBsAg 1 МЕ/мл и сроком хранения не менее одного года при температуре -18-20°С. Растворителем является дистиллированная вода в объеме 1,0 мл на один экземпляр ГСО.

Источником HBs-антигена служит плазма крови, содержащая HBsAg доминирующего в республике генотипа D вируса и не имеющая антител к HBsAg; ВИЧ-1, 2; вирусу гепатита С. Матриксом для разведения HBsAg служит нормальная человеческая плазма (НЧП), не содержащая HBsAg, антител к HBsAg, ВИЧ-1, 2; вирусу гепатита С. Подавление аналитического сигнала матриксом не должно превышать 20%. ГСО не содержит РНК ВИЧ-1, 2, РНК HCV и ДНК ВГВ, инактивирован нагреванием при 65°С в течение 10 ч и при 103°С в течение 90 с.

Метрологическая аттестация ГСО HBsAg по сертифицируемому параметру проведена методом ИФА путем ряда параллельных измерений экземпляров ГСО с экземпляром действующего международного стандарта (Third International Standard for HBsAg (HBV genotype B4, HBsAg subtypes ayw1/adw2) 47,3 IU/ampoule, NIBSC code: 12/226).

Изучены метрологические характеристики разработанного ГСО HBsAg параллельно с действующим МС HBsAg, контролировались содержание HBsAg (специфическая активность), однородность и стабильность серии. Показано, что содержание HBsAg во флаконе ГСО соответствует 1±0,065 МЕ/мл при доверительной вероятности р=0,95 и коэффициенте охвата k=2. Коэффициент вариации однородности образцов не превышает 1%. В процессе изготовления новых серий и хранения ГСО HBsAg будет продолжено изучение его стабильности в динамике.

Поскольку ГСО HBsAg имеет только один сертифицируемый параметр и является средством измерения содержания (специфической активности) этого маркера, возникла очевидная необходимость разработки набора контрольных образцов HBsAg (НКО HBsAg). НКО предназначен для оценки качества ИФА-тест-систем для выявления HBsAg и контроля качества работы диагностических лабораторий при внутрилабораторном и внешнем контроле качества исследований по основным критериям: чувствительность, специфичность, воспроизводимость результатов. На основании анализа зарубежных аналогов и материалов исследований нашего Центра разработан следующий состав НКО.

Отрицательные образцы (19 флаконов) для оценки специфичности диагностических наборов; положительные образцы (6 флаконов) для оценки чувствительности диагностических наборов. Они являются последовательно разведенными аналогами ГСО HBsAg с концентрациями 0,005; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,08 МЕ/мл; положительные образцы с мутантными формами HBsAg (6 флаконов) для оценки способности диагностических наборов выявлять наиболее распространенные мутантные варианты HBsAg (P127T, A128V, М133Т). Общее количество образцов в НКО - 31 флакон. Срок хранения НКО - не менее одного года при температуре минус -18-20°С.

Инактивацию положительных образцов осуществляли нагреванием, контроль полноты инактивации выявляли методом полимеразной цепной реакции.

Образцы НКО HВsAg в лиофилизированном виде герметично закрываются в полимерных флаконах (масса сухого вещества 0,05±0,01 г). Растворителем является дистиллированная вода в объеме 1,0 мл на один флакон НКО.

Изготовлены экспериментальные серии ГСО HВsAg и НКО HВsAg. Проведена сертификация ГСО HВsAg; получен сертификат № 1259 Государственного комитета по стандартизации Республики Беларусь об утверждении типа государственного стандартного образца состава поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). ГСО HВsAg зарегистрирован в Государственном реестре средств измерений под номером ГСО РБ 3119-2016 и допущен к применению в Республике Беларусь с 22.12.2016.

Получено регистрационное удостоверение № ИМ-7.104635, включающее: Мн-7.119021-1603 - ГСО HВsAg и Мн-7.119021/7.002-1603 - НКО HВsAg, на ГСО и НКО HBs-антигена по ТУ BY 10055832.338-2016.

Организовано производство обоих изделий медицинского назначения в РНПЦ эпидемиологии и миробиологии, проведена маркетинговая проработка, начата поставка этой отечественной инновационной продукции.