УДК: 576.54:57.085.23
Год издания: 2017

Метод комплексного определения иммуномодулирующих свойств мезенхимальных стволовых клеток in vitro

Гончаров А.Е.Антоневич Н.Г.Бущик О.В.Чекан В.Л.Стринкевич Э.А.
Рубрики: 34.19.2176.03.55
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Разработать и внедрить метод лечения хронических стенозов трахеи и гортани с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из обонятельной выстилки слизистой оболочки носовой полости».
Сроки выполнения НИР: июль 2016 г. — июнь 2019 г.
Научный руководитель: канд. мед. наук А.Е. Гончаров, канд. мед. наук, доц. В.Л. Чекан.
Источник финансирования: госбюджет.

Несмотря на то, что для клеточной терапии заболеваний иммунной системы активно применяются мезенхимальные стволовые клетки (МСК), до сих пор отсутствует стандартизированный комплексный метод определения иммуномодулирующих свойств МСК. Отбор четких критериев оценки иммуномодулирующей активности позволит сравнивать функциональные свойства МСК различного тканевого происхождения, прогнозировать терапевтическую эффективность биомедицинских клеточных продуктов.

Цель - разработать метод комплексного определения иммуномодулирующих свойств МСК in vitro.

Исследовали in vitro иммуномодулирующую активность МСК обонятельной выстилки (ОВ) человека (15 культур клеток) в отношении Т- и В-лимфоцитов, макрофагов, дендритных клеток (ДК), естественных киллерных клеток (ЕКК) после контактного сокультивирования.

МСК ОВ получали методом эксплантов из биопсийных образцов ткани ОВ средних носовых ходов пациентов с заболеваниями носовой полости и околоносовых пазух (БелМАПО, РНПЦ оториноларингологии).

Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли из образцов венозной крови методом градиентного центрифугирования (25 образцов). Незрелые ДК получали из моноцитов крови с использованием ГМ-КСФ и ИЛ-4 в качестве индукторов дифференцировки. В течение 3-х сут проводили совместное культивирование клеток в соотношениях: МСК ОВ : МПК=1:10-1:20; МСК ОВ : ДК=1:1-1:2. Для определения пролиферации CD4+ Т-клеток перед сокультивированием МПК окрашивали 5(6)-карбоксифлуоресцеин диацетат N-сукцинимидил эфиром (CFSE). Для индукции пролиферации лимфоцитов вносили фитогемаглютинин (ФГА). Влияние МСК ОВ на антигенпредставляющие клетки (АПК) (В-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки) оценивали по изменению экспрессии молекул CD16, CD64, CD68, CD80, CD86, CD206, CD273, CD274, CD284. Иммунофенотипирование клеток методом проточной цитометрии проводили по стандартной методике с использованием моноклональных антител, меченных флюорохромами, и изотипических контролей.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью программы Statistica версии 12 (StatSoft, США). Значения показателей представлены медианой с интерквартильным размахом в виде 25 и 75-й процентилей. Для сравнения групп данных и изучения корреляционных взаимосвязей использовали непараметрические методы. В качестве критерия достоверности различий показателей принимали уровень значимости p<0,05.

На примере МСК ОВ изучена иммуномодулирующая активность МСК на различных популяциях клеток иммунной системы.

На первом этапе работы оценивали влияние МСК ОВ на митоген-индуцированную пролиферацию CD4+ Т-лимфоцитов общей фракции МПК. Супрессивный эффект в отношении пролиферации Т-лимфоцитов описан для наиболее используемых в клеточной терапии МСК костного мозга и жировой ткани и является универсальным свойством всех МСК. Показано, что МСК ОВ статистически значимо снижают митоген-индуцированную пролиферацию суммарной фракции CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови при контактном сокультивировании in vitro. Значение индекса пролиферации МПК в смешанной культуре с МСК составило 1,30 (1,01-1,48) усл. ед., что достоверно ниже показателя в контрольных культурах МПК - 1,95 (1,76-2,41) усл. ед. (p=0,027).

Следующей задачей явилась оценка действия МСК ОВ на цитотоксическую функцию CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и ЕКК общей фракции МПК. Показано, что под влиянием МСК ОВ у ЕК-клеток снижается продукция цитотоксических эффекторных молекул: гранзима В в 2 раза, а перфорина - в 1,5 раза. В то же время МСК ОВ не оказывают выраженного действия на экспрессию перфорина и гранзима В ЦТЛ. Установлено, что МСК ОВ при сокультивировании практически полностью подавляют у ЦТЛ и ЕК-клеток спонтанную дегрануляцию, оцениваемую по экспрессии маркера CD107a. После сокультивирования с МСК ОВ уровень индуцированной дегрануляции при контакте с опухолевыми клетками-мишенями линии Jurkat у ЦТЛ и ЕК-клеток также был достоверно ниже, чем в контрольных культурах.

Выявлена сниженная способность МСК ОВ-индуцированных МПК вызывать апоптоз у клеток-мишеней опухолевой линии Jurkat. В контрольных культурах Jurkat некроз составил 2,3 (1,7-2,9)%, апоптоз - 4,0 (3,8-4,7)%. После инкубирования клеток-мишеней с контрольными МПК число мертвых клеток достоверно возросло в 1,3 раза (р=0,027), в то же время клетки, вступившие в апоптоз, составили 22,2 (18,2-27,3)% через 2 ч совместной инкубации. МСК ОВ-индуцированные МПК также оказывают цитотоксическое действие на опухолевые клетки; некроз был на уровне контрольных МПК, в то время как число апоптотических клеток - на 70% ниже.

Иммуномодулирующий эффект МСК ОВ в отношении ЦТЛ и ЕКК в общей фракции МПК проявляется в подавлении механизмов реализации цитотоксической функции, что приводит к снижению способности эффекторных клеток уничтожать клетки-мишени. Для оценки иммуномодулирующей активности МСК целесообразно учитывать действие только на конечный цитотоксический эффект - способность вызывать апоптоз, причем необязательно исследовать влияние МСК на чистые популяции ЦТЛ и ЕКК, достаточно использовать суммарную фракцию МПК. Полученные данные информативны, не требуют использования дорогостоящих наборов для иммуномагнитной сепарации клеток.

Влияние МСК ОВ на АПК оценивали по изменению в экспрессии поверхностных маркеров. Для всех типов АПК в перечень анализируемых молекул были включены молекулы главного комплекса гистосовместимости II типа HLA-DR, костимуляторные молекулы CD80 и CD86, так как уровень их экспрессии в наибольшей степени характеризует потенциальную способность клеток к презентации антигена. У ДК также анализировали маркер толерогенности CD85k и коингибиторные молекулы CD273 и СD274. Дифференцировку моноцитов оценивали по синтезу молекул, характерных для М1 провоспалительных (CD68, СD80, СВ86, CD274) и М2 противовоспалительных макрофагов (CD16, CD64, CD206, CD273). Показано, что при контактном сокультивировании МСК ОВ подавляют у В-клеток экспрессию молекул HLA-DR по отношению к контрольным культурам (р=0,001) и СD86 (p=0,03) и не оказывают влияния на СD86. МСК ОВ индуцируют противовоспалительный, толерогенный иммунофенотип макрофагов (CD16loCD64loCD80+CD86loHLA-DRloCD273+CD284hi) при контактном сокультивировании, сходный с таковым при М2-поляризации моноцитов.

При контактном сокультивировании с МСК ОВ у незрелых ДК формируется толерогенный, противовоспалительный иммунофенотип CD86loCD80+HLA-DRloCD273hiCD85khi.

Таким образом, можно сделать вывод о схожем влиянии МСК ОВ на антиген-представляющие клетки как миелоидного, так и лимфоидного происхождения (В-клетки, макрофаги, моноцитарные дендритные клетки), что проявляется в снижении (но не полном подавлении) экспрессии маркера иммуногенной активации HLA-DR и костимуляторной молекулы CD86 при одновременном увеличении в популяции числа клеток, экспрессирующих костимуляторную молекулу CD80. Анализ экспрессии СD80, CD86 и HLA-DR отобран для включения в комплексный метод оценки иммуномодулирующей активности МСК как наиболее информативный в отношении функционального состояния клеток.

На основании полученных результатов предложен следующий алгоритм оценки влияния иммуномодулирующего МСК из различных тканевых источников на клетки иммунной системы:

1. Контактное сокультивирование МСК и МПК/ДК в течение 3-х сут (в 3-х повторах):

проба № 1 - МПК + фитогемагглютинин, контроль для оценки пролиферации;

проба № 2 - МСК+МПК (соотношение 1:10) + фитогемагглютинин, оценка влияния МСК на пролиферацию;

проба № 3 - МПК, контроль для оценки фенотипа и цитотоксической активности;

проба № 4 - МСК+МПК (соотношение 1:10), оценка влияния МСК на фенотип и цитотоксическую активность;

проба № 5 - ДК, контроль для оценки фенотипа;

проба № 6 - МСК+ДК (соотношение 1:1), оценка влияния МСК на фенотип.

2. В пробах № 1 и № 2 оценить ФГА-стимулированную пролиферацию CD4+ Т-лимфоцитов общей фракции МПК. Оценка выполняется по интенсивности флюоресценции CFSE (или аналогичных красителей) методом проточной цитометрии, расчет индекса пролиферации с помощью программы MolFit (или аналогичной).

3. В пробах № 3 и № 4 оценить цитотоксическую активность общей фракции МПК в отношении клеток-мишеней. В качестве таковых рекомендовано использовать опухолевую линию Jurkat. Сокультивировать МПК и клетки-мишени в соотношении 5:1 в течение 2 ч, провести учет жизнеспособности по окраске интеркалирующими красителями Annexin V и To-Pro-3 (или аналоги) в популяции CD90+ клеток Jurkat.

4. В пробах № 3-6 оценить фенотип антигенпредставляющих клеток (В-клетки, макрофаги, дендритные клетки) по уровню экспрессии молекул CD80, CD86 и HLA-DR.

Предложенный метод комплексной оценки иммуномодулирующих свойств МСК из различных тканевых источников может быть использован в разработке новых биомедицинских клеточных продуктов, прогнозировании их терапевтической эффективности.

Вид патентной защиты: отсутствует.


Область применения: иммунология, клеточная терапия.
Рекомендации по использованию: внедрение метода комплексного определения иммуномодулирующих свойств мезенхимальных стволовых клеток в практику исследовательских лабораторий учреждений здравоохранения и учебную практику высших учреждений образования Республики Беларусь.
Предложения по сотрудничеству: консультативная помощь при внедрении, обучение на рабочем месте.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2022 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта