Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) представляют собой клетки опухоли, мигрирующие посредством кровотока по всему организму, тем самым обеспечивая последующий рост метастазов в органах и тканях. Выявление ЦОК имеет большое прогностическое значение при злокачественных новообразованиях различной локализации. Сложность определения ЦОК заключается в том, что они содержатся в крови в небольшом количестве, как правило, не превышающем 1-5 клеток на 1 млн всех ядросодержащих клеток.

Цель - разработка метода определения ЦОК в периферической крови пациентов со злокачественными новообразованиями брюшной полости.

В качестве объекта исследования использовали периферическую кровь 7 здоровых доноров и 14 пациентов со злокачественными новообразованиями брюшной полости (рак поджелудочной железы, рак внепеченочных желчных путей, рак желудка) (Минский городской клинический онкологический диспансер).

Клетки определяли методом проточной цитометрии. Для выявления ЦОК в качестве основного маркера использовали EpCAM (CD326) - адгезивную молекулу, которая экспрессируется на поверхности большинства злокачественных клеток эпителиального происхождения. Лейкоциты и другие клетки гемопоэтического происхождения исключали определением на поверхности клеток панлейкоцитарного маркера CD45. В качестве интеркалирующего красителя для исключения мертвых клеток применяли To-Pro3. Конгломераты клеток идентифицировали гейтированием событий на цитограмме SSC-H vs SSC-A.

Учет одной пробы на цитометрах BD FACScanto II и BD FACSCalibur занимает до 60 мин (при скорости учета 5000-10000 событий/с). Для исключения программных сбоев данные записывали в несколько файлов по 1х10⁶ клеток/файл с последующим объединением файлов в один при помощи программы «Hackit: FCS Concatenator». В наших экспериментах наилучшие результаты для быстрого и точного анализа столь большого объема данных достигнуты при помощи программы «FlowJo» (версия 10.0.7).

Исследования показали, что у пациентов со злокачественными новообразованиями брюшной полости их содержание составило от 1 до 10 клеток/мл крови при медианном количестве 4,0 (2,0-7,0) клеток/мл. У здоровых добровольцев ЦОК выявлены не были.

Установлена высокая повторяемость и хорошая воспроизводимость теста. Показано, что для получения достоверных результатов требуется пробоподготовка с использованием большого объема крови и учет значительного количества клеток (не менее 10х10⁶). Важное значение имеет правильный забор и хранение образца крови (антикоагулянт - натриевая соль ЭДТА, срок хранения - не более 24 ч, температура хранения - 18-25°С); аккуратная пробоподготовка, максимально способствующая сохранению в образце ЦОК; идентификация и исключение из учета клеточных дуплетов и других артефактов, мертвых клеток; корректность настройки прибора и параметров учета; используемая аппаратура и программное обеспечение, пригодное к анализу большого числа событий.

Таким образом, нами разработан метод определения ЦОК периферической крови у пациентов со злокачественными новообразованиями брюшной полости. Оптимизированы условия пробоподготовки, учета и анализа ЦОК.

Вид патентной защиты: заявка на изобретение.