До начала настоящих исследований парэховирусная инфекция (ПЭВИ) была практически неизвестной и недиагностируемой инфекционной патологией в нашей стране. Отсутствовала необходимая методическая база для осуществления ее лабораторной диагностики и изучения распространенности в человеческой популяции. Клинические проявления ПЭВИ весьма разнообразны - они варьируют от слабых, субклинических признаков респираторной или кишечной патологии до тяжелых форм, включающих менингиты, энцефалиты и сепсисоподобные заболевания, которые особенно опасны для новорожденных и детей первых двух лет жизни. В связи с тем, что данная инфекция не входит в перечень диагностируемых отечественными лабораториями, какие-либо данные о ее вкладе в структуру инфекционной заболеваемости в Республике Беларусь отсутствуют.

Цель исследования - разработка методики генодиагностики ПЭВИ человека и ее апробация на клиническом материале.

В мировой практике для диагностики ПЭВИ применяются серологические, культуральные, молекулярно-генетические методы. Как известно, последние обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, требует меньше времени и средств на постановку анализа, что дает им определенные преимущества при выборе оптимальной технологии выявления возбудителя. Исходя из этого в основу разработанной нами методики была положена технология ОТ-ПЦР с идентификацией продуктов реакции гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени. На первом этапе после подбора праймеров и зондов (с меткой ROX) для выявления фрагментов, локализованных в 5′НТР регионе генома возбудителя ПЭВИ, была проведена оптимизация условий постановки ПЦР. Подобран следующий режим амплификации: преденатурация 96°С, 3 мин (1 цикл); денатурация 95°С - 15 с, отжиг, элонгация и детекция флюоресценции 58°С - 60 с (45 циклов). Далее для контроля прохождения амплификации была создана положительная контрольная проба «К⁺». Она представляет собой генно-инженерную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, соответствующую участку 5′НТР генома парэховируса. Наличие данной последовательности было подтверждено методом секвенирования. Для исключения ложноотрицательных результатов при выделении вносили внутренний контрольный образец (ВКО), учет которого проводили по каналу FAM. В качестве ВКО была использована армированная РНК бактериофага MS2 (компонент «Набора универсальных контрольных образцов для детекции РНК-содержащих вирусов методом ОТ-ПЦР», ТУ BY 100558032.401-2016).

Созданная методика диагностики ПЭВИ на основе ОТ-ПЦР была апробирована на клиническом материале. Для этого использовали пробы фекалий (n=175), полученные от детей с клиническим диагнозом «острая кишечная инфекция вирусной этиологии». По результатам проведенных исследований 8% проб оказались положительными. При этом доля проб, в которых другие актуальные возбудители вирусных кишечных инфекций (рота-, норо-, адено-, астро-, энтеровирусы) не были обнаружены, но содержали парэховирус, составила 6,8%.

Разработанная и успешно апробированная в клинических условиях методика генодиагностики ПЭВИ рекомендуется для ее широкого использования в лабораторной практике и при проведении биотехнологических и научно-исследовательских работ.