Тест активации базофилов (ТАБ) представляет собой in vitro метод диагностики гиперчувствительности немедленного типа, основывающийся на регистрации маркеров активации и дегрануляции базофилов при их активации причинными аллергенами. Несмотря на то, что принципиальная возможность постановки теста базофилов показана в начале 90-х гг.XX в., до сих пор отсутствуют стандартизированные протоколы ТАБ, что указывает на необходимость оптимизации и стандартизации методики с целью практического применения метода.

Цель исследования - оптимизировать условия тестирования активации базофилов для диагностики IgE-опосредованных реакций, учитывая время забора и температуру хранения образца периферической крови (ПК), положительный контроль, способ гейтирования базофилов на проточном цитометре, повторяемость и воспроизводимость метода, маркеры активации и дегрануляции базофилов.

Исследования проводили с использованием 20 образцов периферической крови здоровых добровольцев, 45 образцов периферической крови пациентов с аллергией на тимофеевку, антигены домашней пыли, β-лактамные антибиотики.

Экспериментальное время хранения образца периферической крови составляло 1 ч (забор крови производится в учреждении, где выполняется исследование); 4 ч (забора крови будет производится в другом учреждении города) и 24 ч (забор крови в другом городе или области). Показано, что образец ПК должен храниться до 4 ч до исследования с целью минимизации ложноположительных и/или ложноотрицательных результатов.

Температура хранения образца периферической крови для проведения ТАБ определяет условия транспортировки. Установлено, что для оптимальной оценки теста активации базофилов хранение и транспортировка образца периферической крови должны осуществляться при комнатной температуре (18-25°С).

С целью оценки специфической отвечаемости базофилов использовали моноклональное антитело к IgE (клон 4H10). Второй неспецифический положительный контроль - ФМА в концентрации 2 нг/мл, учитывая достоверное повышение экспрессии и интенсивности экспрессии маркеров активации и дегрануляции базофилов, а также невысокую стоимость реагента.

Для выбора оптимальной идентификации на проточном цитометре проводили сравнительное исследование семи способов гейтирования: 1) CD123^hi/HLA-DR^neg; 2) CD3^-CD193⁺; 3) CD193⁺; 4) CD45^dimIgE^bright; 5) IgE^hi; 6) CD3^-CD294⁺; 7) CD203c⁺. Показано, что оптимальным способом гейтирования базофилов является CD123+HLA-DR-, учитывая простоту ручного выделения кластера базофилов, наличие минимального количества примеси других клеточных популяций (2,2 (1,6-3,2) %), а также стабильность экспрессии маркеров в процессе специфической активации базофилов.

Коэффициент корреляции при оценке воспроизводимости гейтирования базофилов по CD123⁺/HLA-DR^- составил 0,995. По параметру коэффициента вариации в серии повторных измерений способ гейтирования базофилов CD123⁺/HLA-DR^- соответствует допустимым значениям (до 10%).

В качестве маркеров активации и дегрануляции базофилов использовали молекулу LAMP-семейства CD63 и специфический маркер базофилов CD203c. Показано, что с целью усиления чувствительности метода могут применяться следующие молекулы, характеризующиеся высоким индексом активации: CD11b, CD13, CD69, CD164 и CD300a.

Нами апробирован метод ТАБ для диагностики пыльцевой и лекарственной аллергии (β-лактамные антибиотики). Методом ROC-кривой произведена оценка чувствительности и специфичности ТАБ. Чувствительность составляла 96 и 74% для пыльцевой аллергии и аллергии на β-лактамные антибиотики соответственно, специфичность - 100 и 88%.

Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать и стандартизировать методику проведения теста активации базофилов для практического применения в клинико-диагностических лабораториях учреждений здравоохранения с целью диагностики IgE-опосредованных реакций.

Вид патентной защиты: отсутствует.