УДК: 616.72:002.77 – 07:576.8.077.3 – 092.4
Год издания: 2017

Структурный и иммунохимический анализ карбамилированных белков как антигенов раннего ревматоидного артрита

Марцев С.П.Жоров О.В.Русанович Д.А.Мартусевич Н.А.Скриган Т.Н.Власов А.П.
Рубрики: 31.23.2776.03.3176.29.3176.29.33
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий
Тема НИР: «Получение и характеристика карбамилированных белков синовиальной жидкости как антигенов диагностически значимых аутоантител при раннем ревматоидном артрите и исследование механизмов посттрансляционного карбамилирования ex vivo с целью разработки новых высокочувствительных систем иммунодиагностики»; Государственная программа научных исследований «Фундаментальные и прикладные науки – медицине».
Сроки выполнения НИР: январь 2015 г. — декабрь 2016 г.
Научный руководитель: С.П. Марцев.
Источник финансирования: госбюджет.

На рубеже 2000-х г. показано, что аутоантитела к цитруллинированным полипептидам являются диагностически значимым и ранним маркером ревматоидного артрита (РА) и выступают в качестве одного из первичных факторов патогенеза. По данным ретроспективных исследований появление этих антител на период 1-3 года и более опережает первые клинические симптомы заболевания. Своевременное выявление этих ранних маркеров представляет собой резерв увеличения эффективности терапии. Начиная с 2010 г накапливаются данные в пользу того, что близким по значимости маркером могут служить аутоантитела к белкам синовиальной жидкости суставов, карбамилированным по аминогруппам лизина с формированием гомоцитруллина. Обе группы белков - карбамилированные и цитруллинированные - формируются в организме в результате естественного процесса посттрансляционной модификации. Однако примерно у 1% населения этот нормальный процесс под влиянием ряда факторов инициирует продукцию аутоантител через феномен срыва иммунологической толерантности, запуская механизм РА.

Остатки цитруллина, получаемые дезамидированием аргинина, и остатки гомоцитруллина отличаются на одно метиленовое звено (-СН2-) и представляют собой близкородственные иммуногенные структуры. Этим обусловлено структурное подобие центральной части 2-х типов антигенных детерминант, которые, однако, несут закономерные отличия в своей периферической части, поскольку даже в случае одного и того же белка цитруллиновые остатки будут иметь микроокружение (бывшего) аргинина, а гомоцитруллиновые - лизина. Для развития новых подходов к ранней диагностике РА важно определить степень подобия гомо- и цитруллиновых антигенных детерминант в составе различных белков, а также оценить удельный вклад и степень перекрытия специфичности 2-х популяций аутоантител у лиц с РА. Результат важен также для понимания основных механизмов патогенеза РА с целью создания новых подходов к терапии.

Цель работы - получить набор карбамилированных белков, провести их структурно-конформационный анализ и определить способность взаимодействовать с «ревматоидными» антителами из крови лиц с верифицированным РА. Объектом сравнения служили цитруллинированные пептиды в составе коммерческих диагностических наборов «Anti-CCP» (Orgentec, Германия).

Получены карбамилированные производные белков синовиальной жидкости - альбумина, фибриногена и рекомбинантного виментина, сконструированного нами ранее, а также пула белков фетальной сыворотки телят. Разработаны условия карбамилирования, которые при высоких концентрациях денатурата (до 5-6 М мочевины), цианата натрия Na-N=C=O и повышенной температуре (от 37 до 45-50°C) обеспечивают максимальную глубину карбамилирования на уровне 18-26% от всех остатков лизина.

Для оценки влияния модификации на структурные характеристики белков анализировали третичную структуру и динамику молекулярных форм продуктов модификации. Методы включали электрофорез в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГЕ), гель-хроматографию высокого разрешения (SE-HPLC) и флуоресцентную спектроскопию для анализа компактности микроокружения собственных флуорофоров белка и оценки экспонирования гидрофобных сайтов с помощью флуоресцентного зонда - 8-анилино-1-нафталинсульфоновой кислоты (АНС).

Иммунохимический анализ карбамилированных белков выполнен на основе разработанной иммуноферментной тест-системы, использующей адсорбированные на поверхности лунок полистирольных планшетов карбамилированные белки как «антиген захвата» для «ревматоидных» антител из сыворотки крови пациентов (общее число - 36) с верифицированным РА.

Показано, что при высоких концентрациях денатурата (мочевины) и карбамилирующего агента - цианата, необходимых для максимальной глубины модификации, фибриноген расщепляется до коротких пептидов (менее 6-8 кДа по данным ДСН-ПАГЕ). Пептиды посредством гидрофобных и дисульфидных взаимодействий формируют растворимые высокомолекулярные ассоциаты, в которых ароматические флуорофоры экранированы от тушения водным растворителем, что свидетельствует о компактной третичной структуре пептидных ассоциатов (данные спектров флуоресценции и гель-хроматографии высокого разрешения, SE-HPLC). Тенденция к фрагментации белка при карбамилировании наблюдается также для виментина и в меньшей степени для альбумина.

Ни мочевина без цианата, ни карбамилирование цианатом без мочевины не приводят к фрагментации полипептидной цепи белка. С учетом обнаруженной динамики молекулярных форм результаты использования карбамилированного фибриногена, наиболее часто применяемого другими авторами как «антиген захвата» «ревматоидных» аутоантител, требуют анализа условий получения и физико-химических характеристик продукта модификации.

С помощью сконструированных иммуноферментных систем установлены значительные различия карбамилированных белков по эффективности связывания «ревматоидных» аутоантител. Эффективность определена по двум показателям: 1) иммунореактивности, выраженной величиной максимального сигнала связывания аутоантител; 2) диагностической чувствительности тест-системы, выраженной процентом выявления «положительных» сывороток из общего числа 36 пациентов с верифицированным артритом, т. е. определения процента сывороток, дающих сигнал связывания с антигеном, достоверно превышающий установленный пороговый уровень.

Наибольшую иммунореактивность показали карбамил-альбумин и карбамилированные белки фетальной сыворотки с доминирующим компонентом альбумином (данные электрофореза в ДСН-ПАГ). Несколько ниже оказалась иммунореактивность карбамил-фибриногена, который, тем не менее, следует рассматривать в числе кандидатных белков для выявления «ревматоидных» аутоантител. Неожиданно низкая эффективность показана для карбамил-виментина. Диагностическая чувствительность иммунохимических систем на основе карбамилированных белков в ряду: фетальная сыворотка - альбумин - фибриноген - виментин составила 72, 70, 50 и 5%, соответственно. Композитный твердофазный антиген на основе смеси карбамил-фибриногена и карбамил-альбумина (1:1, w/w) показал диагностическую чувствительность на уровне 75%. Коммерческий набор «Anti-CCP» производства “Orgentec” (Германия), использующий для определения аутоантител иммобилизованные в лунках планшетов цитруллин-содержащие пептиды, показал диагностическую чувствительность на уровне 65%, что соответствует данным литературы.

Полученные результаты совместимы с формируемой в настоящее время концепцией появления на доклинической стадии ревматоидного артрита двух популяций поликлональных антител, направленных к цитруллин- и гомоцитруллин-содержащим белкам и лишь частично перекрывающихся по своей антигенной специфичности. Мы показали, что степень иммунохимического подобия цитруллиновых и гомоцитруллиновых пептидов зависит от структуры белка-носителя, имеющего свою уникальную топографию остатков аргинина и лизина. Установлено, что карбамилированные полипептиды представляют собой эффективный и более доступный по способу получения инструмент выявления аутоантител при ревматоидном артрите. Этот инструмент способен представить альтернативу существующему и находящемуся под патентной защитой методу определения антител к циклическим цитруллиновым пептидам либо, при сочетании двух методов, увеличить диагностическую чувствительность анализа.

Вид патентной защиты: защита возможна на стадии ОКР.


Область применения: медицинская биотехнология, иммунодиагностика, ревматология.
Рекомендации по использованию: разработка иммунодиагностикума, иммуносорбента для гемо- либо плазмосорбции.
Предложения по сотрудничеству: совместная разработка иммунодиагностикума, иммуносорбента для гемо- либо плазмосорбции, изготовление опытных образцов.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2019 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта