Цель - оценка роли морфометрических методов в изучении эффективности клеточной трансплантации при экспериментальном циррозе печени.

Объектом исследования были белые калифорнийские кролики (36 особей). Моделирование цирроза печени проводили путем подкожного введения кролику 50%-го раствора тетрахлорметана (CCl₄) на оливковом масле из расчета 1 мл/кг массы тела два раза в неделю.

Клеточную терапию проводили путем трансплантации аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Источником МСК являлся участок собственной жировой ткани паховой области кролика. Выделение и культивирование МСК проводили по стандартному протоколу. Введение взвеси МСК кроликам осуществлялось путем внутрипортальной инъекции. Количество введенных МСК составило 15х10⁶ клеток для каждого животного.

Все кролики были разделены на 3 группы: две контрольные (группы 1 и 2) и одна экспериментальная (группа 3). Кроликам группы 1 (n=6) не вводили тетрахлорметан. Кроликам группы 2 (n=15) и группы 3 (n=15) был введен тетрахлорметан по описанной методике в течение 5 мес. После развития цирроза печени введение CCl₄ прекращали, а кроликам группы 3 в день его отмены проводили однократную трансплантацию МСК по описанной методике.

Животные выводились из эксперимента в одинаковые сроки: в день отмены тетрахлорметана (по 3 кролика из каждой группы) и через 1 мес. после отмены тетрахлорметана и введения МСК кроликам группы 3 (оставшиеся кролики всех групп). После выведения животных из эксперимента изучали общую морфологическую и морфометрическую картину печени. Кусочки органа фиксировали в 10% растворе формалина, забуференного по Лилли (рН=7,34) в течение 48 ч, и заливали в парафиновые блоки по стандартной методике. Депарафинированные срезы печени окрашивали трихромом по Martius Scarlet Blue и ШИК по Шабадашу. При морфометрическом исследовании оценивали толщину соединительно-тканных септ, выраженность дистрофических изменений гепатоцитов, а также наличие двухъядерных клеток при увеличении 400. Для для сравнительной статистической обработки количественных показателей толщины септ и числа двухъядерных клеток использовался критерий Манна-Уитни. Для оценки дистрофических изменений использовались таблицы 2х2 и точный критерий Фишера. Статистически значимыми считали различия, при которых р<0,05. Расчеты производились с использованием пакета программ Statistica 8 (Statsoft, США).

Введение тетрахлорметана по описанной методике привело к развитию цирроза печени к концу 5 мес. эксперимента (рисунок 1). При патоморфологическом исследовании резецированных долей печени изменения в группах 2 и 3 были равноценны. Определялся выраженный фиброз стромы вокруг триад и центральных вен с формированием мостовидного фиброза, образованием ложных долек и узлов регенерации (рисунок 2А, 3А). Архитектоника печеночных долек была нарушена. В группе 1 при микроскопии отмечалась печень нормального гистологического строения. При морфометрическом анализе медиана толщины соединительно-тканных септ в группе 1 составляла 38,5 (38,3-44,8) мкм, в группе 2 - 72,1 (67,8-77,5) мкм и в группе 3 - 77,3 (70,1-87,2) (рисунок 4). Дистрофические изменения гепатоцитов в группе 1 не определялись, в группе 2 выявлялись во всех 15 случаях и в группе 3 - в 13. Медиана количества двухъядерных клеток в поле зрения в группе 1 составила 2 (2-2), в группе 2 - 4 (4-5) и в группе 3 - 5 (4-5) - рисунок 5.

Через 1 мес. после отмены тетрахлорметана и однократного введения взвеси аутологичных МСК наблюдались существенные различия в патоморфологической картине между кроликами групп 2 и 3. В группе 2 при микроскопии отмечалось сохранение грубых соединительно-тканных септ с формированием ложных долек. В периферических участках печени наблюдались очаги пролиферации сосудов и желчных капилляров в разросшейся соединительной ткани (рисунок 2Б). В группе 3 сохранялись нарушения гистоархитектоники печени за счет фиброзных разрастаний и наличия ложных долек, однако отмечалось хорошо заметное истончение соединительной ткани (рисунок 3Б). Дистрофические изменения наблюдались только по периферии печеночных долек и были слабо выражены, в центральных участках печеночных долек отмечалось появление гликогена в гепатоцитах (рисунок 3Г). Морфометрический анализ подтверждал полученные данные. Через 1 мес. после отмены тетрахлорметана и введения МСК кроликам группы 3 медиана толщины септ в группе 1 составляла 43,6 (23,6-55,2) мкм; в группе 2 - 80,4 (73,9-90,1) мкм и в группе 3 - 53,3 (49,4-57,2) (рисунок 6). Таким образом в группе 3 толщина септ была статистически значимо ниже, чем в группе 2 (р<0,001; z=4,64). Дистрофические изменения гепатоцитов в группе 1 не определялись, в группе 2 - 12 случаев и в группе 3 - 3. Медиана количества двухъядерных клеток в поле зрения в группе 1 составила 2 (2-2), в группе 2 - 6 (5-6) и в группе 3 - 2,4 (2-3) (рисунок 7). Таким образом, в группе 3 количество двухъядерных клеток было статистически ниже, чем в группе 2 (р<0,001; z=4,64).

Таким образом, через 1 мес. после введения МСК кроликам с циррозом отмечается улучшение гистологической картины пораженной печени в сравнении с группой, которой не вводили МСК. Полученные морфологические данные подтверждаются морфометрическими показателями, а именно статистически значимыми истончением соединительно-тканных септ, уменьшением дистрофических изменений в гепатоцитах и количества двухъядерных клеток в группе 3 в сравнении с группой 2.

Рисунок 1
Рисунок 2. — Патоморфологические изменения печени у кроликов группы 2
Рисунок 3. - Патоморфологические изменения печени у кроликов группы 3
Рисунок 4. — Статистическая характеристика групп в зависимости от толщины септ в день отмены тетрахлорметана
Рисунок 5. — Статистическая характеристика групп в зависимости от количества двухъядерных клеток в день отмены тетрахлорметана
Рисунок 6. — Статистическая характеристика групп в зависимости от толщины септ через 1 мес. после введения МСК
Рисунок 7. — Статистическая характеристика групп в зависимости от количества двухъядерных клеток через 1 мес. после введения МСК