Цель работы - молекулярно-генетический анализ полиморфизма маркеров генов интерлейкина-4 (IL-4) и фактора некроза опухоли (TNF-α) у пациентов с циррозом печени (ЦП).

Объектом исследования явились 59 пациентов, находившихся на стационарном лечении в гастроэнтерологическом отделении ГУЗ «ГГКБ №3» по поводу ЦП и 40 здоровых лиц группы сравнения. Группы были сопоставимы по полу (p>0,05; χ²) и возрасту (p>0,05; критерий Манна-Уитни). Диагноз цирроза печени и портальной гипертензии был подтвержден лабораторными и инструментальными методами исследования. Класс тяжести цирроза А по Чайлду-Пью установлен у 19 (32,2%) пациентов, класс В - у 20 (33,9%), класс С - у 20 (33,9%). Структура этиологического фактора: токсико-алиментарный - 11 (18,6%) человек, вирусный - 3 (5,0%), первичный билиарный цирроз - 4 (6,8%), криптогенный - 41 (69,5%). Портальная гипертензия различной степени компенсации как осложнение цирроза печени была выявлена у большинства пациентов (50-84,7%). Варикозное расширение вен (ВРВ) пищевода диагностировано у 50 обследованных, из них: I степени - 9 (18%), II степени -22 (44%), III степени - 19 (38%).

Материалом для исследований явилась ДНК, выделенная из лейкоцитов крови пациентов с применением коммерческих реагентов.

Для проведения молекулярно-генетического анализа были выбраны следующие маркеры:

1) ген TNF-α - замена G308A (rs1800629 по классификации NCBI);

2) ген IL-4 - замена C590T (rs 2243250 по классификации NCBI).

Для выявления SNP (single nucleotide polymorphism - единичный однонуклеотидный полиморфизм) использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом и электрофоретической детекцией с применением реагентов фирмы «ThermoScientific» (США). Для детекции продуктов ПЦР и рестрикционных фрагментов использовали метод горизонтального гель-электрофореза (агарозный гель 1,7 и 2,5% соответственно). Амплификацию проводили на амплификаторе «PalmCycler» фирмы «CorbettResearch» (Австралия), а визуализацию полученных результатов - с помощью видеосистемы «Bio-Rad» GelDocXR (США), программы «QuanitiOne».

Молекулярно-генетические исследования показали, что среди здоровых лиц группы сравнения (n=40) гетерозиготное (C/Т) носительство IL-4 (С590Т) выявлено у 15 (37,5%), гомозиготное (Т/Т) - у 1 (2,5%) (таблица 1). Частота полиморфизма TNFα (G308А) среди здоровых людей составила 22,5% (9 человек) - все они явились носителями гетерозиготного варианта (G/A) (таблица 2). В группе пациентов с ЦП гетерозиготное (C/Т) носительство полиморфизма IL-4 (С590Т) выявлено у 24 (40,7%) пациентов, гомозиготное (Т/Т) - у 2 (3,4%) (таблица 1). Частота встречаемости полиморфизма TNFα (G308А) среди пациентов с ЦП составила 25,4%; все эти 15 человек явились носителями гетерозиготного варианта (G/A) (таблица 2).

Таблица 1. – Частота встречаемости генотипов и аллелей IL-4 590 C/T
Таблица 2. – Частота встречаемости генотипов и аллелей TNF-α

Анализ данных продемонстрировал, что наличие полиморфизма генов IL-4 (ТТ, СТ) и TNF-α (AA, AG) не связано с повышением риска развития цирроза печени (для IL-4: относительный риск RR=1,07; 95% ДИ=0,77-1,48; p>0,05; чувствительность (Se)=0,44; специфичность (Sp)=0,60).

Однако при анализе частоты встречаемости генотипов у пациентов с ЦП в зависимости от класса тяжести заболевания по Чайлду-Пью были выявлены статистически значимые различия: при тяжелом классе цирроза С чаще отмечались полиморфные генотипы исследуемых генов (таблица 3). Имело место увеличение частоты генотипов СТ и ТТ у пациентов с ЦП класса С в сравнении с классом В (относительный риск RR=2,51; 95% ДИ=1,28-4,9; p<0,05; чувствительность (Se)=0,65; специфичность (Sp)=0,8). Отношение шансов (OR)=7,429; 95% ДИ=1,778-31,041; p<0,05.

Таблица 3. – Частота встречаемости генотипов и аллелей IL-4 590 C/T

Также было выявлено статистически незначимое увеличение частоты встречаемости генотипов GA у пациентов с ЦП класса С в сравнении с классом А (относительный риск RR=1,37; 95% ДИ=0,75-2,49; p>0,05; чувствительность (Se)=0,350; специфичность (Sp)=0,789) (таблица 4).

Таблица 4. – Частота встречаемости генотипов и аллелей TNF-α

Проведен анализ частоты встречаемости генотипов у пациентов с ЦП и портальной гипертензией при различной степени ВРВ в пищеводе. Имело место статистически незначимое увеличение частоты встречаемости генотипов СТ и ТТ у пациентов с ЦП и ВРВ пищевода 3-й степени (относительный риск RR=1,569; 95% ДИ=0,82-3,01; p>0,05; чувствительность (Se)=0,526; специфичность (Sp)=0,682), отношение шансов (OR)=2,38 (таблица 5).

Таблица 5. – Частота встречаемости генотипов и аллелей IL-4 590 C/T

У 2 пациентов с декомпенсацией ЦП с развитием тяжелой печеночной недостаточности выявлено монозиготное (ТТ) носительство полиморфизма IL-4. Следует отметить, что данный вид полиморфизма выявлялся редко (3,4%), но всегда ассоциировался с тяжелым течением цирроза печени (класс С) и декомпенсацией портальной гипертензии (ВРВ пищевода 3-й степени, асцит, спленомегалия, энцефалопатия, тяжелая печеночная недостаточность).

Следует отметить, что у пациентов с первично билиарным циррозом печени (n=4) отсутствовали случаи полиморфизма исследуемых генов.

Вероятно, функционально полиморфизм промоторного региона гена IL-4 в позиции -590 С>T ассоциируется с высокой продукцией белка, активацией цитокиновой регуляции воспалительного процесса и механизмов сосудистого ремоделирования и неоангиогенеза в печени.

Сравнительный анализ частоты встречаемости генотипов у пациентов с ЦП в зависимости от класса тяжести заболевания показал, что при тяжелом циррозе печени (С по Чайлду-Пью) чаще встречались полиморфные генотипы (СТ, ТТ) гена IL-4. Монозиготное (ТТ) носительство полиморфизма гена IL-4 ассоциировалось с тяжелым течением цирроза печени (класс тяжести С) и декомпенсацией портальной гипертензии. Однако неоднозначность полученных данных требует расширенных дальнейших исследований.